На чем основана хроматография аминокислот

На чем основана хроматография аминокислот

Разделение и анализ аминокислот и их производных используются при определении аминокислотного состава белков, секвенировании пептидов, а также с целью диагностики нарушений аминокислотного и белкового обмена. В этом разделе рассматриваются два наиболее важных в практическом отношении метода аминокислотного анализа.

А. Ионообменная хроматография свободных аминокислот

Б. Распределительная хроматография ФТЦ-производных аминокислот

В первых вариантах распределительной хроматографии гидрофильной была неподвижная фаза, а гидрофобной — подвижная. Приведенная здесь современная модификация метода носит название обращенно-фазовая хроматография (ОФХ).

Сначала при взаимодействии с фенилизотиоцианатом получают производные аминокислот ( 1 ). ФТЦ-аминокислоты (РТС-аминокислоты) малополярны и благодаря поглощению в УФ-обпасти спектра их можно обнаруживать в элюате фотометрически. В качестве неподвижной фазы используются мелкие частицы силикагеля (диаметром 5 мкм) с привитыми углеводородными цепями (лигандами). Использование мелкодисперсных носителей позволяет повысить качество разделения, однако при этом растет механическое сопротивление колонки. Поэтому высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят в капиллярах или колонках, выполненных из нержавеющей стали, а элюент подают с помощью насосов высокого давления ( 2 ). В качестве элюентов используются системы растворителей с возрастающей концентрацией ацетонитрила (СН 3 СN). Состав подвижной фазы, а следовательно, и качество разделения ( 3 ) оптимизируют с помощью программируемых градиентных смесителей.

Источник

РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ

Разделение аминокислот методом хроматографии на бумаге проводится с целью идентификации аминокислот, находящихся в растворе.

Определение свободных аминокислот важно для изучения обмена белков в организме. В норме в плазме крови и в моче содержится определенное количество аминокислот. При нарушении функции отдельных органов или физиологических систем (недостаточная функция печени, усиленный распад белков, ослабление выделительной функции почек и т.д.) в сыворотке, а иногда и в моче наблюдаются изменения в содержании аминокислот и в аминокислотном составе.

В распределительной хроматографии важен подбор такого органического растворителя (подвижная фаза), при котором различны значения » ά » для отдельных компонентов смеси.

В свою очередь от » ά » зависит коэффициент скорости движения – Rf (retention factor – фактор удерживания), который легко определить практически:

Rf данного вещества зависит не только от качества растворителя (его состава, рН), но и от температуры среды и качества используемой бумаги (плотность, толщина и др.). Поэтому очень важно хроматографию проводить при определенной и постоянной температуре (20-22°) и пользоваться только предназначенной для хроматографии бумагой.

Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен для данных условий опыта. Поэтому им широко пользуются при идентификации веществ при их анализе методом распределительной хроматографии на бумаге. Для этого сравнивают Rf аминокислот исследуемой смеси с Rf известных стандартных аминокислот.

Основные преимущества хроматографического метода – простота, точность данных при незначительных количествах исследуемых веществ (десятые и сотые доли миллиграмма), быстрота и возможность одновременно проводить большое количество анализов.

Ход работы: Для разделения смеси аминокислот вырезают полоску хроматографической бумаги длиной 15-16 см и шириной 1,5 см, в зависимости от величины хроматографической камеры, в которой проводится хроматографирование. В качестве хроматографической камеры могут использоваться большие пробирки, стеклянные цилиндры. Хроматографическую бумагу, можно брать только пинцетом. Один из концов полоски «заостряют», отрезая от него кусочки ножницами, и на нем проводят простым карандашом линию на расстоянии 2 см от края. Этот конец бумаги зажимают между двумя стеклянными пластинками и проводят стеклянной палочкой, смоченной раствором смеси аминокислот, по начерченной линии. После подсыхания полоски вновь наносят порцию аминокислот. Эту процедуру повторяют 3-4 раза.

На дно хроматографической камеры осторожно, не смачивая стенок, наливают из пипетки 1-2 мл смеси бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:5).

Конец хроматограммы, где не нанесена смесь аминокислот, прикрепляют с помощью иголки к пробке, которой плотно закрывают хроматографическую камеру, при этом заостренный конец хроматограммы должен быть погружен в растворитель на 1 см, полоска со смесью аминокислот не должна касаться растворителя, (рис.1). Хроматографирование проводят в течение 1,5-2 часов. За это время проявитель пройдет по хроматограмме путь снизу вверх, равный примерно 10 см. Затем хроматограмму вынимают из камеры, отмечают границу фронта продвижения растворителя (делают надрезы ножницами слева и справа) и высушивают под тягой. На высушенную хроматограмму наносят с помощью пульверизатора 0,5% раствор нингидрина в ацетоне так, чтобы вся хроматограмма была равномерно (без подтеков) смочена раствором. Как только ацетон испарится, хроматограмму помещают в сушильный шкаф при температуре 70°С на 15 минут. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных (синих или фиолетовых) пятен, расположенных на разных расстояниях от места нанесения исследуемой смеси.

На хроматографической бумаге наблюдают нингидриновую реакцию (лабораторная работа №1).

Рис.1. Упрощенный прибор для распределительной хроматографии на бумаге: 1-пробка; 2-иголка; 3-фронт растворителя; 4-пробирка; 5-полоска хроматографической бумаги; 6-место нанесения смеси аминокислот, очерченное карандашом; 7-растворитель.

Идентификацию аминокислот осуществляют по значению Rf. Для этого измеряют с точностью до миллиметра расстояние, пройденное проявителем от линии нанесения аминокислот до границы фронта проявителя. С такой же точностью измеряют расстояние от точки нанесения аминокислот до центра цветного пятна. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента Rf.

Таким же образом вычисляют Rf для стандартных известных аминокислот (хроматограммы с известными аминокислотами ставятся параллельно). И сравнивая Rf известных аминокислот с Rf аминокислот смеси, определяют последние.

ЗНАЧЕНИЯ Rf АМИНОКИСЛОТ (при температуре 20°С)

Источник

Разделение смеси аминокислот методом хроматографии на бумаге

Хроматография является эффективным методом для решения одной из важнейших задач биохимии – разделения и идентификации химических соединений (белков, аминокислот, жирных кислот, моно- и дисахаридов и др.). Метод предложен в 1903 г. профессором Воронежского университета М.С. Цветом для разделения растительных пигментов.

В настоящее время известно большое число различных видов хроматографии (распределительная, адсорбционная, ионообменная, на молекулярных ситах) и различных приемов их применения (на бумаге, колоночная, тонкослойная, газовая). Современные разновидности хроматографии, различающиеся по технике выполнения позволяют быстро разделить отдельные компоненты из небольшого количества сложной смеси.

Принцип распределительной хроматографии состоит в том, что вещества помещают в систему, которая содержит два физически различных компонента- подвижную и неподвижную фазы. Неподвижную (стационарную) фазу называют сорбентом. Если сорбентом служит жидкость, удерживаемая каким-либо твердым телом, то это тело называют носителем или матрицей. Подвижную фазу называют растворителем или проявителем; компоненты разделяемой смеси – растворенными веществами. В варианте распределительной хроматографии на бумаге носителем служит целлюлоза в виде листов хроматографической бумаги. Неподвижной фазой служат пары воды, насыщающие лист этой бумаги при данных условиях. В качестве подвижной фазы применяют насыщенный водой органический растворитель, который, двигаясь по бумаге, растворяет и увлекает за собой нанесенный образец.

Распределительная хроматография основана на том, что растворенное вещество распределяется между подвижной и неподвижной фазами. Этот процесс называется распределением и количественно описывается коэффициентом распределения, представляющим собой отношение концентраций растворенного вещества в каждой из двух фаз. Рассчитывают этот коэффициент по следующей формуле:

,

где, m_п – масса подвижной фазы;

m_н – масса неподвижной фазы;

R_f – коэффициент подвижности (скорости перемещения зоны компонента).

По мере движения растворителя происходит множество микроскопических актов распределения каждого из исследуемых компонентов между подвижной и неподвижной фазами, в результате чего вещества с разными коэффициентами распределения оказываются на различном расстоянии от старта.

Коэффициентом R_f (подвижности) называют отношение расстояния от места нанесения исследуемого вещества до середины пятна (а) к расстоянию, от места нанесения вещества до фронта растворителя (в): R_f = а/в. Каждое из разделяемых веществ имеет свой R_f. Этот коэффициент может быть использован для идентификации (определения) компонентов исследуемой смеси, но воспроизводимость его зависит от условий опыта (температура, сорт бумаги, чистота растворителя, однотипность процедур и др.).

Существуют различные виды хроматографии на бумаге: нисходящая (растворитель движется по бумаге сверху вниз), восходящая (растворитель движется по бумаге снизу верх), круговая (движение растворителя происходит от центра круга к периферии) и др. В учебных целях наиболее удобна круговая (радиальная) хроматография.

Все операции с хроматографической бумагой проделывают тщательно вымытыми перед работой руками или в чистых резиновых перчатках. Надписи на бумаге делают простым карандашом.

ХОД РАБОТЫ. Работа состоит из нескольких этапов, которые выполняются в определенной последовательности:

1.Разметка и маркировка хроматографической бумаги. Из хроматографической бумаги вырезают квадрат со стороной на 0,5 см больше диаметра используемой для работы чашки Петри (рис.3).

Двумя перпендикулярными линиями, проведенными карандашом через центр, квадрат делят на четыре сектора. По краю каждого сектора делают простым карандашом надпись о наносимом веществе.

На взаимно перпендикулярных прямых, отступив от центра 1,5 см к краю каждой стороны квадрата, сделать карандашом метки (1). Это будет место для нанесения пробы (стартовая линия).

2. Нанесение растворов. В отмеченные точки микропипеткой наносят растворы аминокислот (в соответствии с надписью) или смесь в объеме 0,002-0,01 мл. Нанесение осуществляют прикосновением острого конца заполненной микропипетки к бумаге в отмеченную точку и быстром ее поднятии. При этом на бумаге должно оставаться пятно диаметром не более 3-4 мм. После полного подсыхания пятна операцию повторяют. Так поступают до тех пор, пока весь раствор из микропипетки не будет перенесен на отмеченную точку (стартовую линию).

В центре хроматограммы просверливают отверстие (2) и в него вставляют фитилек (трубочку, скрученную из хроматографической бумаги). Фитилек (3) должен плотно прилегать к краям отверстия, высота его должна быть несколько меньше, чем внутренняя высота камеры.

3. Приготовление растворителя. В колбу объемом 100 мл приливают бутанол, уксусную кислоту и воду в соотношении 12:3:5 и тщательно перемешивают. Полученный раствор наливают в одну из половин чашки Петри по 15-20 мл, приготовленного для разделения смеси аминокислот.

4. Разгонка аминокислот. Хроматограмму укладывают на половинку чашки так, чтобы фитилек располагался в центре и касался ее дна. Для уменьшения испарения растворителя хроматограмму накрывают второй половиной чашки, добиваясь совмещения краев чашек.

Насыщенный неподвижной фазой растворитель по фитильку непрерывно поступает к центру хроматограммы и, двигаясь к краям, растворяет нанесенные аминокислоты и увлекает их за собой. При этом каждая из аминокислот движется по слою бумаги с определенной скоростью, что обусловлено коэффициентом распределения. Скорость аминокислот неодинакова, так как зависит от степени их растворения в неподвижной и подвижной фазе растворителя. Аминокислоты с полярными незаряженными, отрицательно и положительно заряженными (гидрофильными) радикалами движутся медленно, вместе с водой, некоторые чуть впереди воды. Аминокислоты с неполярными, гидрофобными радикалами перемещаются быстрее, так как вода, продвигаясь по бумаге, выталкивает их, а бутилово-уксусная фракция – увлекает за собой. Скорость перемещения аминокислот одновременно зависит от величины и объема радикала.

После того как растворитель дойдет почти до краев чашки, хроматограмму снимают, удаляют фитилек, простым карандашом проводят линию между сухой и мокрыми зонами бумаги (отмечают границу фронта растворителя) и высушивают в вытяжном шкафу.

5. Проявление. Хроматограмму смачивают в налитом в ванночку растворе с массовой концентрацией нингидрина в ацетоне 1 %, вновь высушивают в вытяжном шкафу и помещают для развития окраски пятен аминокислот на 1,5-2 мин в сушильный шкаф при температуре 100 °С или прогревают над плиткой до полного развития окраски комплексов аминокислот с нингидрином.

6. Определение коэффициента подвижности аминокислот. Описывают кратко принцип метода бумажной хроматографии, определяют R_f аминокислот-метчиков и аминокислот смеси, идентифицируют аминокислоты смеси, хроматограмму зарисовывают. Замеряют расстояние, пройденное каждой аминокислотой от точки старта до середины пятна (а), и расстояние пройденное растворителем в данном секторе (в). По формуле рассчитывают коэффициент подвижности:

7. Идентификация аминокислот, содержащихся в смеси, осуществляется по совпадению их позиций с позицией аминокислот-метчиков на хроматограмме, по совпадению коэффициентов подвижности и по однородности окраски пятен.

R_f для аминокислот при разделении на бумаге растворителем, состоящим из бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 12:3:5 приведены в табл.7.

Коэффициенты подвижности аминокислот (R_f)

Хроматографический метод позволяет произвести и количественное определение аминокислот в смеси. Для этого пятна аминокислот смеси и аминокислот-метчиков обводят карандашом, нумеруют, вырезают, делают в них надрезы и помещают в пробирки с соответствующим пятну номером.

Затем в пробирки наливают по 3 мл насыщенного сульфатом меди раствора с объемной концентрацией этанола 80 %, содержимое в пробирках перемешивают и ставят в темное место на 30 мин (каждые 10 мин содержимое пробирок перемешивают). Окраска с бумаги переходит в раствор этанола с образованием медных производных сине-фиолетового Руэмана, окрашенных в красный цвет. Оптическую плотность окрашенных растворов аминокислот-метчиков и аминокислот смеси измеряют при 540 нм (зеленный светофильтр) на ФЭКе против насыщенного сульфатом меди раствора с объемной концентрацией этанола 80 %. Массовую концентрацию каждой аминокислоты в смеси рассчитывают по формуле:

,

где, Х – массовая концентрация аминокислоты в исследуемой смеси, мг/мл;

С – массовая концентрация аминокислоты-метчика (свидетеля), мг/мл;

D_пр – оптическая плотность раствора с пятна аминокислоты смеси;

D_св – оптическая плотность раствора с пятна аминокислоты метчика.

Результаты расчетов по количественному составу аминокислот смеси записывают и делают окончательный вывод по всей работе.

РЕАКТИВЫ. Хроматографическая бумага; вода дистиллированная; органический растворитель (бутанол, ледяная уксусная кислота, вода в соотношении по объему 12:3:5); этанол; раствор с массовой концентрацией нингидрина в ацетоне 1 %; смесь аминокислот (взвешивают по 10 мг лизина, аланина и лейцина, смешивают вместе и растворяют в 10 мл раствора с объемной концентрацией этанола 80 %, при отсутствии какой-либо из аминокислот для приготовления смеси можно взять другие аминокислоты с существенно отличающимися величинами R_f); растворы аминокислот-метчиков, или «свидетелей» (10 мг каждой из аминокислот, взятых для приготовления смеси, растворяют в отдельных флаконах в 10 мл раствора с объемной концентрацией этанола 80 %); раствор с объемной концентрацией этанола 80 % насыщенный сульфатом меди.

1. Общая характеристика метода хроматографии и ее роль в биохимии.

2. Назовите основные виды хроматографии.

3. Общая характеристика принципа хроматографии.

4. Назовите разновидности метода хроматографии на бумаге и чем они отличаются.

5. Назовите основные этапы радиальной хроматографии на бумаге.

6. Техника разметки и маркировки хроматографической бумаги.

7.Техника нанесения растворов в точки старта.

8. Состав и техника приготовления растворителя для «разгонки» аминокислот на бумаге.

9. От чего зависит скорость движения аминокислот в процессе хроматографии.

10. Как рассчитывается коэффициент подвижности (R_f) и что он характеризует?

11. Что такое «идентификация аминокислот» и как её проводят.

12. Назовите основные этапы количественного определения аминокислот методом хроматографии на бумаге.

13. Техника экстрагирования окрашенных пятен.

14. Как определяется содержание аминокислот в 1 мл смеси.

Источник

На чем основана хроматография аминокислот

Разделение и анализ аминокислот и их производных используются при определении аминокислотного состава белков, секвенировании пептидов, а также с целью диагностики нарушений аминокислотного и белкового обмена. В этом разделе рассматриваются два наиболее важных в практическом отношении метода аминокислотного анализа.

А. Ионообменная хроматография свободных аминокислот

Б. Распределительная хроматография ФТЦ-производных аминокислот

В первых вариантах распределительной хроматографии гидрофильной была неподвижная фаза, а гидрофобной — подвижная. Приведенная здесь современная модификация метода носит название обращенно-фазовая хроматография (ОФХ).

Сначала при взаимодействии с фенилизотиоцианатом получают производные аминокислот ( 1 ). ФТЦ-аминокислоты (РТС-аминокислоты) малополярны и благодаря поглощению в УФ-обпасти спектра их можно обнаруживать в элюате фотометрически. В качестве неподвижной фазы используются мелкие частицы силикагеля (диаметром 5 мкм) с привитыми углеводородными цепями (лигандами). Использование мелкодисперсных носителей позволяет повысить качество разделения, однако при этом растет механическое сопротивление колонки. Поэтому высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят в капиллярах или колонках, выполненных из нержавеющей стали, а элюент подают с помощью насосов высокого давления ( 2 ). В качестве элюентов используются системы растворителей с возрастающей концентрацией ацетонитрила (СН 3 СN). Состав подвижной фазы, а следовательно, и качество разделения ( 3 ) оптимизируют с помощью программируемых градиентных смесителей.

Источник

Качественный анализ аминокислот методом хроматографии

Работа призёра открытой городской научно-практической конференции «Старт в медицину» в секции «Химия в фармации и медицине»

Актуальность

Изучение аминокислотного состава тканей и биожидкостей человека – одна из главных задач аналитической химии, клинической биохимии, медицины, токсикологии и криминалистики. Нарушение баланса содержания α-аминокислот в тканях, органах и биожидкостях может указывать на возникновение различных патологий.

Цель

Обнаружить аминокислоты методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и круговой бумажной хроматографии (КБХ) и изучить их свойства.

Задачи

1. Изучить с помощью литературных источников различные виды анализа аминокислот и обосновать выбор метода анализа для проведения эксперимента.

2. Подобрать условия для хроматографического разделения аминокислот.

3. Провести разделение смесей аминокислот методами ТСХ и КБХ (идентификацию) и определение степени разделения (Rf) аминокислот.

4. Познакомиться со способами обнаружения аминокислот.

5. Подтвердить методом ТСХ наличие аминокислот в лекарственных препаратах.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Алюминиевая пластинка для ТСХ, покрытая силикагелем

Описание

На первом этапе автор проводил разделение смеси аминокислот (валин, изолейцин, лейцин) методом распределительной бумажной хроматографии (КБХ). Для этого приготовили растворы аминокислот с концентрацией 1 мг/мл и смесь органических растворителей, используемых в качестве подвижной фазы в соотношении: бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:1), время насыщения – 1,5 часа. На фильтровальной бумаге наметили карандашом вертикальную линию старта в центре круга радиусом 3–4 см. В центр фильтра капилляром нанесли каплю раствора анализируемого вещества в несколько приёмов, периодически высушивая круглый фильтр. Затем вырезали полоску бумаги длиной до центра окружности, шириной 1,5–2 см и погрузили в растворитель. Круглый фильтр поместили вниз в хроматографическую камеру и опустили полоску для подачи растворителя. Потом аккуратно вынули фильтровальную бумагу из камеры, подсушили круглый фильтр и обработали из пульверизатора 0,2%-ым раствором нингидрина в ацетоне в камере для распыления.

На втором этапе автор разделил смеси аминокислот методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и рассчитал величины Rf для аминокислот. Использовали пластинки TLC Silica gel 60 (20×20). Сначала приготовили растворы аминокислот с концентрацией 1 мг/мл и подвижную фазу в соотношениях: бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:1) (если рассчитывать на 24 мл общего объёма: (16:4:4), время насыщения составило 1,5–2 часа. На пластинке для ТСХ провели карандашом линию старта (не нарушая слой сорбента) на расстоянии 1 см от края и нанесли капилляром растворы аминокислот и смесей аминокислот так, чтобы диаметр пятна не превышал 4–5 мм, а центр пятна находился на линии старта. Подсушили пластинку и вновь нанесли анализируемую смесь на линию старта, затем опять подсушили. Пластинку с нанесённой пробой (выше слоя растворителя) поместили вертикально в хроматографическую камеру. Затем пинцетом аккуратно вынули пластинку из камеры (стакана), карандашом отметили линию фронта растворителя, подсушили пластинку над плиткой и обработали из пульверизатора 0,2%-ым раствором нингидрина в ацетоне в камере для распыления. Потом её снова подсушили при +70–80 °C в течение 3–5 мин. Отметили характерную окраску пятен раствором нингидрина. По результатам хроматографического анализа рассчитали величины Rf для аминокислот Rf=l/L.

На третьем этапе автор провёл качественное определение аминокислот в лекарственных препаратах методом ТСХ. Для исследования использовали таблетки препаратов «Глицин», «Глутаминовая кислота» и «Элтацин».

Результаты

1. Методом КБХ смесь аминокислот (валин, изолейцин, лейцин) разделилась недостаточно качественно.

2. Проведена идентификация аминокислот и разделение 3 смесей аминокислот методом ТСХ. Определены степени разделения (Rf) аминокислот. Наибольшей хроматографической подвижностью обладает тирозин, наименьшей глицин. С раствором нингидрина аминокислоты валин, изолейцин и лейцин дают по-разному окрашенные соединения.

3.Качественное определение аминокислот в трёх лекарственных препаратах методом ТСХ показало, что в препаратах «Глицин» и «Элтацин» присутствует аминокислота глицин, но поскольку в «Элтацин» входят также глутаминовая кислота и вспомогательные вещества, пятно глицина слабее уходит со старта. Глутаминовая кислота присутствует в препаратах «Глутаминовая кислота» и «Элтацин».

Выводы

1. Все аминокислоты обладают разной хроматографической подвижностью, что позволяет провести разделение их смесей.

2. Метод ТСХ имеет по сравнению с другими методами хроматографического анализа ряд преимуществ: экспрессивность, универсальность, наглядность и информативность, простота проведения, что особенно актуально для школьников, которые только начинают знакомство с различными методами анализа биологически важных веществ.

Перспективы использования результатов работы
Метод ТСХ является полуколичественным, поэтому используя данный метод, можно примерно определить массовые доли аминокислот в различных лекарственных препаратах, содержащих аминокислоты. Используя данную работу, можно изучить методы хроматографии на примерах КБХ и ТСХ.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра аналитической, физической и коллоидной химии.

Награды/достижения

II Городская Сеченовская конференция проектных и исследовательских работ школьников – призёр.

Мнение автора

«Я учусь в медицинском классе и в будущем планирую получить профессию врача, поэтому мне было интересно и важно познакомиться со свойствами аминокислот, методом хроматографического анализа.

Проект «Медицинский класс в московской школе» дал мне базовые знания в области фармации, медицины, что помогло мне при создании исследовательской работы.

Подготовка и участие в конференции «Старт в медицину» стала стимулом для глубокого погружения в тему исследования, дала опыт общения с интересными людьми, позволила почувствовать уверенность в своих силах и представить результаты исследования»

Источник