На что реагирует пцр тест
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.
ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.
Суть метода ПЦР
ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.
Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.
Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.
Преимущества метода ПЦР
Какие есть недостатки
Показания к проведению ПЦР-анализа
Подготовка к проведению ПЦР-теста
Как проводится ПЦР-анализ
Результаты ПЦР-теста
Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.
Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.
Цепная реакция. Как работают тесты на коронавирус?
Как выглядят тесты на COVID-19, как они устроены, насколько точны и насколько доступны российским врачам? Об этом СПИД.ЦЕНТР поговорил с научной журналисткой, заместителем главного редактора портала PCR.news и профессиональным биологом Еленой Клещенко.
— Первый вопрос: а как вообще выглядит тест на коронавирус? Экспресс-тест на ВИЧ мы все видели: белая лопаточка с ручкой и пробирка с реагентом. Через 15 минут готов результат. Новый коронавирус тестируется по методу полимеразной цепной реакции (ПЦР). Насколько вообще его сложно производить?
— Выглядит тест на коронавирус как пробирки с прозрачными жидкостями в коробочке или пакетике, как-то так. Но чтобы провести саму реакцию и получить результат, нужно еще специальное оборудование.
Производить тест умеренно сложно, это высокие технологии, но очень хорошо отлаженные за много лет. Ограничения — как на любом производстве: реагенты и материалы, производственные мощности и должная культура производства — не надо объяснять, что будет, если чихнуть в пробирку, — плюс кадры. Каких объемов реально достигнуть — зависит от того, какие мощности будут задействованы: если, например, какие-то линии, которые сейчас производят ПЦР-тесты для других инфекционных заболеваний, волевым решением перебросить на SARS-CoV-2, производство возрастет.
— Почему сейчас тестируют коронавирус именно по методу ПЦР, а не иммуноферментного анализа, например, как ВИЧ? С ИФА диагностика была бы быстрее, дешевле? Или это вообще не имеет значения?
За подробностями лучше обратиться к специалистам в области молекулярной диагностики. Но, на мой взгляд, ПЦР с обратной транскрипцией, а именно он используется в случае с COVID-19, — хороший метод. Для ПЦР-тестов характерна высокая чувствительность. В их основе лежит амплификация нуклеиновой кислоты, то есть даже при малом количестве копий в образце можно получить хороший сигнал. Кроме того, для разработки таких тестов нужен, по большому счету, только геном вируса или часть генома.
— По факту ПЦР-тесты для COVID-19 появились почти сразу после того, как китайцы опубликовали расшифровку генома вируса. То есть для того, чтобы начать их разработку, не нужно было никаких образцов, хватило журнальной публикации и специалистов, способных быстро разработать технологию.
— Да. В том и прелесть ПЦР-теста, что для него достаточно генома вируса. Зимой, как только первый геном был опубликован, специалисты во всех странах начали заказывать синтез генетического материала nCoV-19. Зная нуклеотидную последовательность генома, в лаборатории можно получить участок этого генома и дальше экспериментировать уже с ним. В частности, проверить чувствительность и специфичность теста, используя вместо клинических образцов растворы ДНК.
В январе у ученых большинства стран вообще и не было другого выхода, настоящие пациенты имелись только в Китае. К такому методу могут быть претензии. Например, если чувствительность теста проверяется по растворам кДНК, не учитываются потери при обратной транскрипции. Тут разные другие тонкости. Но в целом ученые сработали очень оперативно.
КАК УСТРОЕН МЕТОД ПЦР?
ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом.
Он основан на многократном копировании (амплификации) определенных участков вирусной ДНК в лабораторных условиях. По факту, чтобы «засечь» вирус в организме, с помощью специального фермента, собирающего из нуклеотидов по образцу вирусной ДНК ее копию, ученые дублируют фрагменты генетического материала вируса, пока их число не станет настолько большим, что будет возможно зафиксировать его присутствие с помощью флуоресцентных меток.
Как это работает?
Сначала вирусную ДНК выделяют из материала, представленного в лабораторию, денатурируют: на этом этапе двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C, чтобы цепи ДНК разошлись. Затем добавляют так называемые праймеры — начальные звенья цепочки, которые необходимы для старта синтеза новой копии, и так называемую полимеразу — тот самый фермент, который и будет заниматься репликацией ДНК.
Как правило, для лабораторной ПЦР используются ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, поскольку в течение реакции смесь многократно охлаждают и нагревают. На следующем этапе в смесь из ДНК, полимеразы и праймеров добавляются нуклеотиды — то есть строительный материал для воспроизводства, после чего емкость с нею нагревается до 37°C, и процесс запускается.
На последующей стадии элонгации полимераза начинает синтез на каждой из двух цепочек разделенной ДНК недостающей пары. Происходит это по принципу комплементарности: фермент присоединяет напротив каждого нуклеотида, из которых состоят ДНК, противоположный. По завершении реакции цикл неоднократно повторяется (см. видео ниже).
В случае с вирусами, содержащими не «двойную» ДНК молекулу, а «одинарную» РНК (а это коронавирусы, или, например, ВИЧ), ученым приходится сначала провести обратную транскрипцию РНК с помощью фермента обратной транскриптазы, а уже потом производить амплификацию по той схеме, что была указана выше. Именно так, собственно, поступает и сам вирус, попадая в клетку, перед тем как встроить свою ДНК в человеческую и приступить к синтезу собственных белков, из которых состоит его «тело» (то есть не генетического материала, а самих вирусных частиц, при ПЦР же, наоборот, копируется генетический материал, а не новые частицы вируса).
Ингибиторы обратной транскриптазы — одни из самых распространенных видов лекарств от ВИЧ-инфекции. К ним относятся, например, зидовудин и ламивудин — самые первые препараты АРВТ, разработанные еще в 80-х.
Производится ПЦР на специальных приборах, амплификаторах, или так называемых термоциклерах (Thermal cycler).
Наглядно, как работает метод ПЦР, можно посмотреть на приведенном ниже видео.
— Что касается ИФА-тестов для коронавируса, их разработать так и не успели?
— Почему? Тесты на определение антител к антигенам SARS-CoV-2 в крови существуют. У теста на антитела свои преимущества. Но я бы сказала так: они с ПЦР-тестом дополняют друг друга. Тест на антитела лучше работает на поздних стадиях. Антитела в крови сохраняются и тогда, когда вирус исчезает из организма, то есть с помощью такого теста можно узнать, кто переболел COVID-19 в прошлом.
— Даже если у пациента не было выраженных симптомов и дело обошлось без госпитализации?
— А что за организации, кто в нашей стране занимается этими тестами? Роспотребнадзор?
— Роспотребнадзор — это очень обширная структура. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» в нее входит, он и разработал тесты, которыми пользуются в лабораториях Роспотребнадзора. То есть производит тесты «Вектор», а проводят тестирование региональные центры Роспотребнадзора. Также на данный момент зарегистрирована тест-система от ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Минздрава России (ЦСП).
У каждого теста есть погрешность. При низкой заболеваемости ложноположительных результатов может быть намного больше, чем выявленных реальных пациентов, даже если тест вполне хороший.
О разработке своих тестов заявили и некоторые другие организации — Научно-исследовательский институт микробиологии Минобороны РФ совместно с компанией СИНТОЛ, НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Минздрава России (НИЦ им. Н. Ф. Гамалеи), компания «ДНК-технология». Производство собственных тест-систем планирует запустить Центр молекулярной диагностики CMD (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). И это хорошо, когда есть разные тест-системы, их можно сравнить, проверить результаты одной с помощью другой.
На первом заседании координационного совета по борьбе с коронавирусом вице-премьер РФ Татьяна Голикова сказала, что правительство ждет от регионов предложений о том, на базе каких еще лабораторий можно будет проводить эти исследования. Частные компании тоже смогут делать тесты на коронавирус на платной основе. Возможно, в самом скором времени будет новая информация о том, как все это будет происходить.
— На 15 марта появилась информация, что в России было произведено почти 110 тысяч тестов на коронавирус. Это много для наших масштабов или мало?
— По поводу возможности произвести достаточное количество тестов — тут много вопросов: производственные мощности, которыми мы располагаем, количество реагентов, которые понадобятся, наконец, лаборатории с необходимой техникой и обученным персоналом, где эти тесты проводить. Мало нам будет пользы и от миллиона тестов, если не хватит рук, чтобы эти тесты запускать. Все эти вопросы надо исследовать.
— Российских тестов несколько. В чем их принципиальные отличия? Почему государство выбрало именно те, что сделали в «Векторе»?
— Пока в России зарегистрировано три теста — два от «Вектора» и один от ЦСП. У тест-системы ЦСП чувствительность указана выше, есть внутренний контроль — РНК, которую добавляют в образец. Если эта РНК исчезнет в процессе, не даст сигнала, значит, что-то пошло не так. Это знак, что могла исчезнуть и вирусная РНК, а стало быть, отрицательный результат следует считать ложноотрицательным. Про остальные тест-системы поговорим, когда они получат регистрационные удостоверения.
Почему государство выбрало именно «Вектор» для выполнения этого задания, мне неизвестно. Наверное, могли бы выбрать и, например, ЦНИИ эпидемиологии того же Роспотребнадзора. «Вектор» знаменит тем, что в нем работают с опасными патогенами, а «уханьский коронавирус» на тот момент выглядел очень пугающе: и по смертности среди заболевших, и по инфекционности были прямо страшные оценки. Может быть, в этом причина, может быть, в чем-то другом, это надо узнавать у тех, кто принимал решение.
ПЦР-диагностика
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).
Принцип ПЦР- исследования
Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?
Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.
Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.
В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.
Как это все происходит в лаборатории
Выделение ДНК
Элонгация
Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.
Детекция
Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:
Преимущества методики ПЦР
Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).
Области применения в медицине
В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.
Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:
12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция
12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция
Авторы
Редакторы
Полимеразная цепная реакция почти для каждого из нас стала обыденностью, даже если этот каждый никогда и слов таких не слышал. Медицинские центры наперебой предлагают диагностировать у вас все мыслимые болезни с помощью «ПЦР-анализа». Но задумывались ли вы о том, что это за анализ? как там всё работает? для чего еще применяют ПЦР? и есть ли какие-то альтернативные, менее дорогие, трудоёмкие и, может быть, более эффективные методы анализа? Нет? А мы вам всё равно об этом расскажем.
12 биологических методов в картинках
Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Партнер этой статьи — Bio-Rad
Компания Bio-Rad Laboratories, Inc. USA («Био-Рад», США) является одним из мировых лидеров производства оборудования и реагентов для научных исследований. В рамках взаимодействия с научными, медицинскими, биотехнологическими и образовательными организациями «Био-Рад» предлагает современные технологии, оборудование и реагенты.
Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?
И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков.
Изобретение ПЦР полностью и безвозвратно изменило медицину, науку и нашу жизнь в целом. Появилась возможность быстро и эффективно диагностировать наследственные заболевания и инфекции, определять личность преступников по одному волоску и свободно манипулировать генами. Не будь этого уникального метода, человечество вряд ли оказалось бы на пороге эпохи генной терапии.
История метода
1957 г. Американец Артур Корнберг впервые выделил из бактерий Escherichia coli фермент, который назвал ДНК-полимеразой [1]. Статьи с описанием работы он отправил в Journal of Biological Chemistry, где их отвергли. из-за названия фермента: рецензенты считали, что нужно использовать более точный термин «полидезоксирибонуклеотидполимераза» и что вообще «ДНК» в названии указывает на «генетическую активность» (сущность, составляющую?) фермента, а раз ее нет, то и называть фермент так нельзя [2]. Однако в 1958 году в журнале сменился главный редактор, и статьи наконец увидели свет [3]. А уже в 1959 году Артура Корнберга удостоили Нобелевской премии по физиологии и медицине.
1971 г. Норвежский биохимик Хьелль Клеппе (рис. 2) опубликовал в Journal of Molecular Biology статью, в которой описал метод, очень похожий на ПЦР [4]. С 1968 по 1970 годы Клеппе работал постдоком в Университете Висконсина, в лаборатории Хара Гобинда Кораны — нобелевского лауреата 1968 года за расшифровку генетического кода. Именно в лаборатории знаменитого индийца чуть раньше разработали методики синтеза олигонуклеотидных праймеров — «затравок», необходимых для работы ДНК-полимеразы.
Рисунок 2. Хьелль Клеппе.
Статья, написанная Клеппе в соавторстве с Кораной и посвященная репарационной репликации с помощью ДНК-полимеразы, содержала такие строки: «Можно ожидать, что после охлаждения получатся две структуры, каждая из которых содержит полноразмерную матричную цепь, подобающим образом связанную с праймером. Для завершения процесса репаративной репликации нужно будет добавить ДНК-полимеразу. В результате получатся уже две молекулы исходного дуплекса. Цикл можно повторять, каждый раз добавляя свежую порцию фермента».
К сожалению, эта гипотеза так гипотезой и осталась. Может, Клеппе даже и проводил какие-то эксперименты, но результаты не публиковал.
1976 г. Ученые из США, Эллис Чиен, Дэвид Эдгар и Джон Трела, выделили термостабильную ДНК-полимеразу из бактерии Thermus aquaticus и назвали ее Taq-полимеразой [5]. Этот фермент сохранял активность даже при температурах выше 75 °С.
1977 г. Фредерик Сенгер, английский биохимик и лауреат Нобелевской премии 1958 года за работы по структуре белков [6], предложил метод секвенирования ДНК, сейчас известный как метод Сенгера [7], [8]. Этим он заработал еще одну нобелевскую медаль, в 1980-м, и стал единственным ученым в истории, получившим две «химических» премии [9].
1983 г. Руководитель лаборатории синтеза ДНК в Cetus Corporation (США) Кэри Мюллис (рис. 3) апрельской ночью ехал вдоль побережья из Сан-Франциско в Мендосино, в свой загородный дом. Долгой трехчасовой дорогой он обдумывал отнюдь не проведение выходных, а предстоящий эксперимент по секвенированию ДНК. И тут (по словам Мюллиса) его озарило: он ясно представил процесс амплификации (преумножения) генов, который позже получит название полимеразной цепной реакции.
До работы в Cetus Кэри Мюллис изучал химию в Технологическом институте Джорджии, затем биохимию в Калифорнийском университете в Беркли, а после работал постдоком в Калифорнийском университете Сан-Франциско по направлению «фармацевтическая химия». В 1979 году его пригласили в Cetus синтезировать праймеры для секвенирования, а уже через два года Мюллис возглавил лабораторию синтеза ДНК и автоматизировал производство олигонуклеотидов [10].
Рисунок 3. Кэри Мюллис.
В 1983 году Мюллис участвовал в проекте по изучению серповидноклеточной анемии. Чтобы проанализировать мутации, биологи проводили секвенирование по Сэнгеру, где используется один праймер для синтеза по одной из цепей ДНК. На серпантине по пути в Мендосино Мюллис предположил, что данные будут точнее, если использовать два праймера — для синтеза одновременно по двум цепям. Тогда можно будет сравнить получившиеся фрагменты и исключить неточности. И вот тут-то неожиданное прозрение заставило его вздрогнуть: если повторить цикл несколько раз, то можно получить множество копий нужного фрагмента строго определенной длины — она будет ограничена праймерами, от концов которых навстречу друг другу и будут строиться новые цепи ДНК [11]!
Вернувшись в понедельник в Cetus, Кэри Мюллис сразу направился в библиотеку, где попросил одного из сотрудников найти всю литературу о ДНК-полимеразе. В результате он не обнаружил ничего, касающегося амплификации. Это утверждение — самое слабое место во всей истории, так как в собранной библиотекарем стопке статей просто не могло не быть работы Хьелля Клеппе.
За следующие полгода Мюллис провел два эксперимента для проверки своей гипотезы, но безуспешно. Тогда он предположил, что отрицательный результат связан с большим размером ДНК-матрицы, используемой в опытах, и решил продолжить работу с маленьким вектором pBR322, в который вставил намножаемый ген. И 16 декабря 1983 года Мюллис впервые увидел вожделенные, хоть и слабые, полосы в геле для детекции. Однако другие сотрудники и руководство Cetus не разделили радости Мюллиса: их всё это попросту не интересовало [10].
1984 г. На ежегодной конференции корпорации Cetus в калифорнийском Монтерее Кэри Мюллис представил плакат, рассказывающий об амплификации гена β-глобина. К удивлению автора, и на этот раз его работу обошли вниманием [10].
Чуть позже Мюллису удалось кое-как убедить корпоративных боссов в важности его экспериментов: Cetus, как и многие начинающие компании, вкладывала ресурсы только в те проекты, что сулили прибыль в краткосрочной перспективе. Его освободили от обязанностей главы лаборатории и дали год на исследования ПЦР. И эти эксперименты завершились успешно [10].
1985 г. Мюллис и его группа разработчиков подали заявку на патент, который утвердили 28 июля 1987 года. В том же 1985-м в Cetus начали использовать для ПЦР термостабильную Taq-полимеразу, что значительно упростило работу: раньше перед каждым новым синтетическим циклом в смесь надо было добавлять новую порцию фермента, потому что он быстро выходил из строя от высоких температур. В декабре 1985 года журнал Science опубликовал первую статью Кэри Мюллиса о ПЦР [12].
Тогда же открылось совместное предприятие PerkinElmer Cetus Instruments (PECI), которое выпустило первый прототип ПЦР-циклера — Mr. Cycle (рис. 4). И только в 1987 году в продажу поступил первый общедоступный прибор, PCR-1000 Thermal Cycler.
Рисунок 4. Mr. Cycle — первый прототип ПЦР-амплификатора.
После ухода из Cetus он два года возглавлял молекулярно-биологический отдел в Xytronyx, а в 1992-м открыл компанию по продаже ювелирных изделий с амплифицированной ДНК знаменитостей — Элвиса Пресли, Мэрилин Монро и т.п. [14].
В 1993 году Кэри Мюллис стал лауреатом Нобелевской премии по химии за изобретение ПЦР. Его награждение — до сих пор больной вопрос для норвежского научного сообщества, где первооткрывателем метода считают Хьелля Клеппе.
Сейчас Мюллису 72 года, он работает научным сотрудником Научно-исследовательского института детской больницы Окленда и с 2011 года возглавляет предприятие Altermune LLC, занимающееся изучением иммунитета [14].
Кэри Мюллис нередко выступает на конференциях, рассказывает о своей жизни, работе и, конечно, своем открытии (см. видео 1). Он — прекрасный рассказчик, его всегда интересно слушать.
Видео 1. Выступление Кэри Мюллиса на конференции TED2002
В 1998 году вышла книга Кэри Мюллиса «Танец обнаженного разума» (Dancing naked in the mind field), где в обрамлении автобиографических историй ученый высказывает своё мнение о глобальном потеплении, СПИДе и других волнующих общество вопросах. Мюллис верит в астрологию и считает, что значительного изменения климата не происходит, между ВИЧ и СПИДом нет никакой связи, а все исследования, говорящие об обратном, — плоды заговора ученых-карьеристов с правительствами их стран.
1987 г. Компания Cetus подала патентную заявку на метод ПЦР с Taq-полимеразой, и ее одобрили в октябре 1990 года.
1989 г. Журнал Science объявил Taq-полимеразу молекулой года, а статья сотрудников Cetus о ПЦР с ее использованием [15] несколько лет поддерживала статус самой цитируемой биологической публикации [16].
В августе химический гигант DuPont подал против Cetus иск, в котором утверждал, что патенты на ПЦР получены неправомерно, поскольку этот процесс еще в 1970-х описал Хьелль Клеппе. В ответ на иск Ведомство по патентам и товарным знакам США (USPTO) решило переосвидетельствовать патенты. Но через год объявило, что они останутся действительными: комиссия нашла метод, описанный в работе Клеппе, слишком «неопределенным и сомнительным». К тому же там не упоминалась возможность экспоненциальной репликации — отличительной черты ПЦР. В суде представители DuPont так и не смогли доказать вторичность изобретения Мюллиса. 28 февраля 1991 года, после двух дней работы, суд вынес решение в пользу Cetus [10].
С тех пор Hoffman-La Roche и ее «дочка» Roche Molecular Systems развивают метод полимеразной цепной реакции: у них уже более 1000 связанных с ПЦР патентов и заявок.
Принцип метода
Все мы знаем, что ДНК — это двухцепочечная молекула, где каждая цепочка состоит из звеньев-нуклеотидов. Нуклеотиды составлены из трех молекул: остатка фосфорной кислоты, сахара и азотистого основания. Если сахар и фосфат одинаковы у всех нуклеотидов в ДНК (в РНК сахар другой), то азотистых оснований четыре (если не считать редкие модификации): аденин, тимин, цитозин и гуанин, обозначаемые А, Т, Ц и Г соответственно. В молекулах РНК тимин заменен урацилом. Нуклеотиды соединяются в цепочку, образуя связи между фосфатной группой одного нуклеотида и гидроксильной — другого. В результате на одном конце каждой цепи ДНК «висит» фосфатная группа (5ˊ-конец), а на другом — гидроксильная (3ˊ-конец). Две цепи нуклеотидов расположены в молекуле ДНК антипараллельно, то есть напротив 3ˊ-конца одной находится 5ˊ-конец другой. Чтобы молекула была стабильной, цепочки должны как-то взаимодействовать друг с другом. Это обеспечивают водородные связи, образующиеся между азотистыми основаниями противоположных цепей по принципу комплементарности: А соединяется только с Т (или У в РНК), а Г — с Ц (рис. 5, видео 2). И поэтому, имея одну цепь ДНК, в соответствии с этим правилом легко построить ее пару. Собственно, на этом и основана ПЦР.
Рисунок 5. Строение ДНК.
Видео 2. Строение ДНК.
Типичная реакционная смесь
Рисунок 6. Состав смеси для ПЦР.
Реагенты для ПЦР от «Диаэм»
Основная трудность при постановке ПЦР любой вариации — создать «правильный коктейль» из ингредиентов: выделенной ДНК, ферментов, трифосфатов и буфера в строго определенном оптимальном соотношении. Соблюдение правильного соотношения — большая проблема для лабораторий, где в сутки проводят несколько тысяч ПЦР: достаточно незначительно изменить концентрацию солей магния, и результаты ПЦР будут далеки от идеала.
Готовые смеси для ПЦР: «Экстрамиксы»
Чтобы упросить жизнь лаборантам, «Диаэм» выпускает готовые смеси — «Экстрамиксы» для ПЦР — как для классической вариации, так и для ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»
Все компоненты смешивают в нужном объеме деионизованной воды в специальных пробирках для ПЦР и помещают в амплификатор (или ПЦР-циклер) (рис. 7, видео 3).
Рисунок 7. Расходные материалы и оборудование для ПЦР. а — ПЦР-пробирки. б — Амплификатор C1000 Touch™ производства Bio-Rad.
Видео 3. Приготовление смеси для ПЦР.
Этапы реакции
Цель ПЦР — получить множество одинаковых двухцепочечных кусочков ДНК строго определенной длины (обычно не более 2–3 тысяч пар нуклеотидов, т.п.н.). Для этого проводят 20–30 циклов реакции. Каждый цикл состоит из трех этапов.
1. Денатурация
Чтобы полимераза могла работать, две цепи ДНК-матрицы нужно разъединить. Для этого реакционную смесь нагревают до 94–98 °С. В таких условиях разрушаются водородные связи между азотистыми основаниями параллельных цепей.
2. Отжиг праймеров
На этом этапе праймеры специфично присоединяются к освободившимся цепям ДНК-матрицы с разных сторон копируемого участка 3ˊ-концами друг к другу (рис. 8, видео 4). Чтобы праймеры могли комплементарно связаться (отжечься) только с нужными участками, при их конструировании необходимо учитывать такую важную характеристику, как температура плавления (Тm). Это расчетная температура, при которой половина праймеров присоединяется к целевому участку ДНК. Отжиг проводят при температуре на 1–5 °С ниже Tm, но не выше оптимальной температуры работы полимеразы, то есть в пределах 40–72 °С [17].
Рисунок 8. Полимеразная цепная реакция. На стадии денатурации цепи ДНК разъединяются, на следующем этапе (отжиг) к ним присоединяются праймеры, а далее полимераза начинает свою работу — синтез новых цепей ДНК (элонгация). И такой цикл повторяется многократно.
Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.
Видео 4. Полимеразная цепная реакция.
В идеале праймеры должны соответствовать следующим критериям:
Еще лучше, если на 3ˊ-конце праймера будет гуанин или цитозин: они образуют с комплементарными основаниями три водородные связи (между А и Т образуются две), что делает комплекс праймер—матрица более стабильным.
В реальности редко получается соблюсти все условия из-за множества причин. Однако чем больше критериев соблюдено при создании праймеров, тем выше вероятность правильной их работы.
Чтобы разработать эффективные праймеры, необходимо знать последовательность ДНК у концов целевого участка, и, руководствуясь упомянутыми критериями, выбрать подходящие фрагменты, которым будут комплементарны будущие праймеры. Всё это удобно делать в специальных компьютерных программах — например, PrimerSelect: они и Тm рассчитают, и всякие спаривания изобразят, и вообще вынесут вердикт, удачная это пара праймеров или нет.
3. Элонгация, или синтез ДНК
Однажды ведущий ПЦР-специалист одного ветеринарного диагностического центра, показывая студентам постановку реакции, объяснила, что она потому называется полимеразной, потому что ее результаты наблюдают в полимерном геле. Возможно, есть и другие приверженцы этой гипотезы, однако сразу отметим, что она не верна. Полимеразная эта реакция от того, что в ее ходе фермент ДНК-полимераза последовательно выстраивает цепь ДНК (полимер) из нуклеотидов (мономеров), то есть полимеризует их. И делает она это на третьем этапе ПЦР.
Этот этап чаще проводят при температуре 72 °С — оптимальной для работы Taq-полимеразы. Фермент присоединяется к комплексам праймер—матрица и, выхватывая из раствора нуклеотиды, начинает по принципу комплементарности прилаживать их к 3ˊ-концу праймера (рис. 7). Удлинение, или элонгация, новой цепи ДНК идет с максимальной скоростью 50–60 нуклеотидов в секунду (то есть около 3000 в минуту). Однако при программировании ПЦР-циклера задают время с запасом: по минуте на каждую тысячу пар нуклеотидов.
Каждая вновь синтезированная цепочка ДНК становится, наравне со старой, матрицей для синтеза в следующем цикле. Таким образом, количество нужного продукта в процессе реакции возрастает экспоненциально. После прохождения всех циклов в реакционной смеси образуется столько специфических двухцепочечных продуктов, что их «массив» можно увидеть невооруженным глазом — проведя гель-электрофорез, о котором расскажем ниже.
К сожалению, экспоненциальная амплификация не может длиться вечно. Через 25–30 циклов количество функциональных молекул полимеразы в реакционной смеси истощается. Но чтобы добиться еще большего выхода продукта, содержимое пробирки можно разбавить, например, в 1000 раз и снова использовать для амплификации с уже новыми рабочими компонентами [18].
«Диаэм»: ДНК-амплификаторы на любой вкус
Амплификаторы нуклеиновых кислот с детекцией продуктов по конечной точке для качественной ПЦР и для наработки НК с целью последующего секвенирования: отечественные («ДНК-Технология») и зарубежные (Bio-Rad, Eppendorf, Thermo Fisher Scientific); с возможностью загрузки образцов как в индивидуальных пробирках и стрипах, так и в планшетах на 96 и 384 лунки; с возможностью установки температурного градиента и без; автономные и с подключением к ПК.
Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»
Визуализация продуктов ПЦР
Чтобы увидеть, намножились ли нужные участки ДНК, после окончания ПЦР содержимое пробирок подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле с последующим окрашиванием — так молекулы ДНК разной длины разделяются пространственно и становятся видны невооруженным глазом [19]. Полиакриламидный гель намного плотнее, поэтому больше подходит для разделения очень коротких фрагментов (несколько десятков пар нуклеотидов), при этом можно увидеть разницу даже в один нуклеотид!
Расплавленный при 65 °С гель заливают в специальную форму (плашку) с установленной в ней гребенкой, формирующей лунки (рис. 9). Когда гель застывает, гребенку вынимают, ставят форму в камеру для электрофореза и заливают специальным буфером. Затем в лунки микропипеткой вносят раствор из ПЦР-пробирок, смешанный с краской — чаще бромфеноловым синим. Чтобы потом определять размеры амплифицированных фрагментов, в отдельную лунку вносят маркер молекулярных масс (ladder), содержащий набор кусочков ДНК известных размеров. Камеру подключают к источнику питания и наблюдают за бегущими от электродов волшебными пузырьками. Десятки минут или несколько часов, зависит от размера фрагментов ДНК, плотности геля и приложенного напряжения (видео 5).
Рисунок 9. Подготовка геля для горизонтального электрофореза.
Видео 5. Электрофорез в агарозном геле.
Благодаря отрицательно заряженному сахарофосфатному остову ДНК, фрагменты движутся в геле под действием электрического поля от отрицательного катода к положительному аноду. Более короткие молекулы делают это быстрее, чем длинные. Бромфеноловый синий нужен для того, чтобы следить за продвижением фронта проб в геле и не допустить их выхода за его пределы.
После окончания электрофореза гель вынимают из плашки и, чтобы увидеть расположение фрагментов, вымачивают в растворе флюоресцентного красителя, прочно связывающегося с ДНК. Иногда его вводят в гель еще до залития плашки. Если красителем служит бромистый этидий, внедряющийся между нуклеотидами ДНК, визуализацию проводят под ультрафиолетом (рис. 10).
Рисунок 10. Амплифицированные участки ДНК в агарозном геле после электрофореза. Показаны результаты BOX-PCR — варианта rep-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR), в котором с праймером BOX-A1R намножаются повторяющиеся внегенные палиндромы (BOX-мотивы) бактерий. Метод BOX-ПЦР — один из видов геномной дактилоскопии. Он обладает высокой разрешающей способностью, позволяя различать бактерии на уровне штаммов: картина распределения амплифицированных фрагментов в геле уникальна для каждого штамма. Вертикальные дорожки — отдельные пробы, соответствующие разным бактериальным штаммам; горизонтальные полоски на каждой дорожке — фрагменты ДНК разной длины.
фото автора статьи
Если экспериментатор преследовал цель просто понять, есть ли нужная последовательность нуклеотидов в ДНК-матрице, то после визуализации гель выбрасывают. Но нужные фрагменты несложно из геля выделить для дальнейшей работы: чтобы резать их на кусочки для сравнения с другими фрагментами, вставлять в плазмиды для дальнейшего изучения, секвенировать и т.д.
«Диаэм»: гель-документирующие системы и электрофорез
Для визуализации результата гель-электрофореза нуклеиновых кислот, окрашенных красителем, используют специальные устройства — трансиллюминаторы. При этом детекцию проводят как визуально, так и с помощью автоматизированных систем захвата и обработки изображения — гельдокументирующих систем.
Для повышения контрастности картинки, получаемой при детекции амплифицированных фрагментов в агарозном геле, компания Vilber разработала трансиллюминаторы с технологией Super-Bright. Эффективность данной технологии по сравнению с обычным УФ-трансиллюминатором хорошо видна на фото ниже. Специальный светофильтр полностью убирает видимый диапазон свечения ламп, что значительно повышает контрастность получаемой картинки, позволяя детектировать даже малые количества НК в геле.
Данная технология реализована на базе автономных трансиллюминаторов Vilber, а также в составе автоматических гель-документирующих систем E-Box, универсальных систем Fusion FX и высокочувствительных систем Infinity.
«Диаэм»: оборудование для классической ПЦР:
Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»
Типы ПЦР
Мы описали типичную качественную ПЦР, позволяющую узнать, есть нужная последовательность в анализируемом образце или нет. В качестве матрицы мы всегда упоминали ДНК, но бывают случаи, когда в распоряжении экспериментатора есть лишь РНК (при исследовании РНК-вирусов) или только она может дать необходимую информацию (при определении уровня экспрессии генов). Тогда используют ПЦР с обратной транскрипцией, или ОТ-ПЦР (RT-PCR; не путать с real-time PCR!).
Помимо качественной, существует количественная ПЦР — для определения количества исходной матрицы в образце. Это ПЦР в реальном времени, или real-time PCR. Ее тоже можно проводить в двух вариантах: с ДНК-матрицей и РНК-матрицей.
ПЦР с обратной транскрипцией
Полимеразная цепная реакция может идти исключительно на матрице ДНК, поэтому если у экспериментатора есть мРНК (матричная РНК, на основе которой строятся клеточные белки), то сначала ее надо как-то «переписать» в ДНК. Для этого применяют реакцию обратной транскрипции, в которой фермент обратная транскриптаза по матрице РНК строит комплементарную ДНК (кДНК) [20]. А потом с этой ДНК проводят обычную ПЦР, как описано выше (рис. 11).
Рисунок 11. Схема ОТ-ПЦР. К одноцепочечной РНК-матрице присоединяется праймер, и обратная транскриптаза синтезирует цепь ДНК, которая потом сама уже служит матрицей для синтеза ДНК в процессе обычной ПЦР.
Впервые ОТ-ПЦР упомянули в 1988 году в журнале Science, в статье о синтезе факторов роста макрофагами [21].
Эту реакцию обычно осуществляют с помощью двух ферментов — обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы — либо в двух пробирках (в первой при 37 °С по матрице РНК синтезируют кДНК, затем во второй проводят стандартную ПЦР), либо в одной (все реагенты смешивают вместе, дают отстояться 1 час при 37 °С и помещают в циклер). У каждого из подходов есть свои недостатки и достоинства. В первом случае высока вероятность ошибок при пипетировании и загрязнения образца при переносе во вторую пробирку. Но при этом, однажды проведя обратную транскрипцию, полученную кДНК можно использовать в нескольких экспериментах с разными целями. Во втором случае в ПЦР участвует вся синтезированная кДНК, и повторить реакцию уже невозможно. Однако время проведения эксперимента существенно сокращается. Первый вариант применяют для исследования некоторого набора генов, а второй — при большом количестве образцов, но малом количестве изучаемых генов.
Но ОТ-ПЦР можно проводить и с одним ферментом — Tth-полимеразой. Эту термостабильную полимеразу выделили в 1985 году из бактерии Thermus thermophilus HB-8 [22]. Фермент обладает двойной активностью: в присутствии ионов магния — полимеразной, а в присутствии ионов марганца — обратнотранскриптазной. Причем обе реакции могут идти при 70 °С, что очень важно в случае ГЦ-богатых РНК, которые охотно образуют «шпильки»: высокая температура поддерживает матрицу в денатурированном состоянии, повышает специфичность отжига праймеров и позволяет эффективно копировать сложные молекулы [17].
Однако здесь есть и проблема: в присутствии марганца точность полимеразы сильно снижается, и кДНК содержит множество ошибок. Чтобы этого избежать, после реакции обратной транскрипции в пробирку вносят EDTA, которая образует с марганцем устойчивый комплекс, тем самым выводя его из реакции. Затем добавляют магний и проводят ПЦР [17].
ОТ-ПЦР незаменима при работе с вирусами, геном которых представлен молекулой РНК, в диагностике некоторых видов рака по специфическим транскриптам опухолевых клеток, а также в генной инженерии, если нужно экспрессировать эукариотический ген в бактериальных клетках.
ПЦР (и ОТ-ПЦР) в реальном времени
Этот метод еще называют qPCR (quantitative PCR, или количественная ПЦР), поскольку он позволяет не только обнаружить в пробе целевую нуклеотидную последовательность, но и измерить количество ее копий, а значит, и рассчитать, сколько же было исходной матрицы. Этой матрицей может быть как ДНК (qPCR), так и РНК (RT-qPCR). Понятно, что в последнем случае первой стадией будет обратная транскрипция.
ПЦР в реальном времени разработали в 1992 году в Калифорнии сотрудники Roche Molecular Systems [23]. Они добавили в смесь для ПЦР флуоресцентный краситель бромистый этидий (EtBr) и запустили реакцию под ультрафиолетовым светом, который заставлял EtBr светиться. Весь процесс, а следовательно, и усиление свечения при накоплении копий ДНК, исследователи записали на видеокамеру. Затем они смогли подсчитать исходное число копий целевого фрагмента в реакционной смеси.
Метод real-time PCR не требует визуализации продуктов реакции с помощью гель-электрофореза — их накопление фиксируют в реальном времени оптические датчики, вмонтированные в амплификатор и настроенные на определенную длину волны, испускаемую флуоресцирующими метками (рис. 12). При этом используют два типа меток: интеркалирующие агенты («коллеги» EtBr) и зонды с флуорофорами [24].
Рисунок 12. Амплификатор для qPCR CFX384 Touch™ от Bio-Rad.
Самый популярный интеркалирующий агент — SYBR Green, флуорофор, резко увеличивающий флуоресценцию (в 1000 раз) после связывания с двухцепочечной ДНК (рис. 13). Таким образом, увеличение флуоресценции будет пропорционально увеличению количества ДНК в каждом цикле ПЦР. К сожалению, интеркалирующие агенты обладают низкой специфичностью: они могут связываться и с «побочными» продуктами реакции, и с димерами праймеров. Однако тщательный подбор праймеров и условий ПЦР минимизируют этот недостаток [24].
Рисунок 13. Некоторые виды меток для ПЦР в реальном времени.
Систем зондов с флуорофорами достаточно много (рис. 13). Подробно разберем лишь три самых распространенных.
Применяют ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии генов, одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) и хромосомных аберраций, для обнаружения конкретных патогенов и, в последние годы, белков (иммуно-ПЦР в реальном времени) [26].
«Диаэм»: всё оборудование и реагенты для ПЦР на одном сайте
ДНК-амплификаторы для ПЦР в реальном времени для решения любых задач: от узкоспециализированных приборов для медицинских учреждений до универсальных широкопрофильных систем для лабораторий научного направления.
Амплификаторы НК с детекцией в режиме реального времени: отечественные («ДНК-Технология») и зарубежные (Bio-Rad, Eppendorf, Thermo Fisher Scientific); с возможностью загрузки образцов как в индивидуальных пробирках и стрипах, так и в планшетах на 96 и 384 лунки; имеющие от 3 до 6 каналов детекции; автономные, с подключением к ПК и интегрируемые в автоматизированные станции.
Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»
Иммуно-ПЦР в реальном времени
Рисунок 14. Схема иммуно-ПЦР в реальном времени.
ПЦР служит для качественного и количественного определения в пробе нуклеиновых кислот. Но во многих случаях необходимо детектировать ферменты, гормоны, токсины, антитела и другие молекулы. В большинстве случаев для этого используют метод ИФА (иммуноферментный анализ). Чувствительность метода позволяет определять даже несколько нанограммов антигена в пробе, однако отдельные молекулы ИФА выявить не в состоянии [27].
Чтобы устранить такой недостаток, ученые решили попробовать соединить ИФА и ПЦР. Технологию иммуно-ПЦР (иПЦР, IPCR) разработали сотрудники Калифорнийского университета в Беркли в 1992 году [28]. Сначала для визуализации результатов использовали гель-электрофорез, но сегодня в большинстве случаев применяют ПЦР в реальном времени.
Суть метода заключается в следующем. Пробы, где ищут нужную молекулу (гормон, токсин и т.п.), помещают в специальные пробирки, материал которых обладает высокой антигенсвязывающей способностью и термостойкостью. Далее к пробам добавляют специфические антитела с «пришитыми» к ним ДНК-метками длиной 150–300 п.н. (существует множество вариантов таких систем, но здесь разберем самый простой). Когда антитела присоединятся к искомым молекулам (антигенам), иммобилизованным на стенках пробирок, производят многократную промывку, чтобы удалить непрореагировавшие меченые антитела (рис. 14). Затем в эти же пробирки заливают смесь для qPCR (с интеркалирующим агентом или зондом), помещают их в циклер и проводят реакцию, во время которой амплифицируются ДНК-метки на антителах, связанных с антигенами. Так получают сведения не только о наличии антигенов в пробе, но и об их количестве [29], [30].
Иммуно-ПЦР по разрешающей способности превосходит ИФА на 2–5 порядков и выявляет антиген даже когда невозможно сконцентрировать пробу либо на ранних стадиях бактериальной или вирусной инфекции. Не менее полезно и то, что иПЦР позволяет одновременно обнаруживать много разных антигенов, так как к антителам «пришиты» разные ДНК, амплифицируемые с уникальными праймерами, для которых можно использовать зонды разных конструкций [27], [30].
Применяют иммуно-ПЦР для поиска в пробах вирусных антигенов (например, ВИЧ), опухолеассоциированных антигенов (например, фактора роста эндотелия сосудов), прионов, бактериальных белков, токсинов (в том числе и небелковых, например, диэтилфталата) и других веществ [31].
Direct PCR, или ПЦР без выделения ДНК
Интересный продукт для ПЦР — наборы для постановки прямой реакции полимеризации. Для такой ПЦР не требуется выделения ДНК, достаточно просто добавить образец в пробирку с реагентами, проинкубировать и провести реакцию полимеризации.
Созданы наборы для прямой ПЦР тканей растений, цельной крови и мягких тканей лабораторных животных. Это решение позволяет сэкономить время, которое требуется на выделение НК, снизить риск перекрестной контаминации, а также потерю НК на стадии выделения.
Direct PCR не идеальна для точного количественного анализа, но такие наборы широко используются как экспресс-метод качественного анализа в полевых мобильных лабораториях и для предварительного скрининга большого количества образцов.
«Диаэм» — всё что нужно для ПЦР:
Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»
Варианты проведения реакции
Сегодня существуют десятки вариантов проведения ПЦР для разных целей, для повышения специфичности и эффективности. Разберем лишь несколько наиболее популярных и интересных.
ПЦР с горячим стартом
Известно, что Taq-полимераза может проявлять небольшую активность при комнатной температуре и даже когда пробирка с реакционной смесью находится во льду. Поэтому фермент всегда добавляют в смесь непосредственно перед запуском реакции. Но если, например, проб много, то какие-то из них некоторое время будут стоять уже с полимеразой, пока экспериментатор внесет ее во все пробирки. В этом случае есть вероятность получения неспецифически амплифицированных фрагментов.
Чтобы избежать такой неприятности, используют ПЦР с горячим стартом (hot start PCR), где в смесь добавляют полимеразу в комплексе с антителами, блокирующими ее активность. На первой стадии ПЦР (при 95 °С) антитела денатурируют, полимераза освобождается и только тогда начинает работу.
Ступенчатая ПЦР
При оптимальной температуре отжига праймеры иногда могут связываться и с не идеально комплементарными им участками, а вот если эту температуру немного повысить (например, до 72 °С), то специфичность гибридизации праймеров с матрицей можно существенно увеличить. На этом и основана ступенчатая ПЦР (touchdown PCR): первые циклы проводят при повышенной температуре отжига, постепенно снижая ее до оптимальной в следующих циклах. В результате поначалу вероятность неспецифичной амплификации снижается до минимума, а далее уже размноженные копии нужного фрагмента будут успешно конкурировать за праймеры с не полностью комплементарными им участками ДНК-матрицы.
«Холодная» ПЦР
COLD-PCR (CO-amplification at Lower Denaturation temperature-PCR) используют, когда необходимо выявить, например, однонуклеотидную мутацию гена, но при этом проба содержит ДНК-матрицу как с мутантным геном, так и с геном «дикого типа». Такая смесь типична для биоптатов или образцов крови онкологических больных, и потому этот анализ востребован в медицине для ранней диагностики рака или его рецидивов, а также для назначения индивидуальной терапии на основе молекулярного профилирования. Если делать стандартную ПЦР, то амплифицируются и мутантные, и немутантные аллели интересующего гена, причем последних будет значительно больше, и выявить мутацию будет очень трудно.
Принцип «холодной» ПЦР основан на том, что замена даже одного нуклеотида в одной из цепей ДНК-фрагмента приводит к изменению его температуры плавления, то есть температуры, при которой две цепи ДНК отсоединяются друг от друга. Это изменение составляет обычно 0,2–1,5 °С для фрагментов длиной до 200 п.н. Такая пониженная температура называется критической температурой денатурации (Тс): при ней эффективность ПЦР резко падает из-за малого числа денатурированных матриц [32]. То есть при Тс матрицы «дикого типа» денатурировать уже не будут, но будут те, в которых одна из цепей содержит нуклеотидную замену, отчего их Tm снижается до значения Тс. Для получения таких коротких диагностических матриц интересующий фрагмент вначале выделяют из тотальной ДНК биоматериала с помощью стандартной ПЦР. Мутантные формы среди этих фрагментов ищут уже с помощью COLD-PCR, которая проходит в несколько этапов (рис. 15):
После окончания всех циклов реакции полученные копии интересующего фрагмента секвенируют, чтобы точно установить место и тип мутации.
Рисунок 15. Схема «холодной» ПЦР.
Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.
ПЦР длинных фрагментов
Применяют, когда нужно амплифицировать очень длинные фрагменты — более 5 т.п.н. В long-range PCR часто используют две полимеразы: Taq и Pfu. Первая может за один проход синтезировать длинную цепь ДНК, но при этом «застревает», совершив ошибку, потому что не умеет вырезать только что вставленные нуклеотиды. Вторая полимераза менее процессивна, зато способна исправлять ошибки. Так они друг другу и помогают: Taq ошибается, а Pfu исправляет, давая возможность «подружке» закончить синтез.
Мультиплексная ПЦР
Бывают случаи, когда в одной пробе необходимо выявить сразу несколько последовательностей. Например, при инфекции несколькими патогенами, при диагностике комплекса заболеваний или при выявлении мутаций (рис. 16). И чтобы не проводить много реакций, экономят время и реактивы — применяют мультиплексную ПЦР (multiplex PCR), то есть ПЦР со множеством праймеров. Суть ее в том, что в одну пробирку с ДНК-матрицей добавляют целый набор праймеров для одновременной амплификации нескольких интересующих фрагментов [24], [33].
Рисунок 16. Результаты мультиплексной ПЦР ДНК пациента с миодистрофией Дюшенна. К дистрофии приводят различные мутации экзонов гена белка дистрофина. На дорожке 7 нет полосы, соответствующей экзону 48 (длиной 506 п.н.) этого гена.
Однако при этом надо соблюдать такие условия:
Это ПЦР случайных полиморфных фрагментов ДНК — Random Amplification of Polymorphic DNA. К RAPD прибегают, когда нужно различить сходные геномы: виды бактерий, сорта растений, породы собак и т.д. Используют небольшой праймер (до 10 н.), который может гибридизоваться со многими случайными участками генома. Если правильно подобрать последовательность праймера и условия реакции, то в геле после электрофореза пробы будут отличаться друг от друга количеством и (или) расположением полос.
При всей схожести метода с rep-PCR, описанной под рисунком 10, последнюю всё-таки считают независимой техникой, отличающейся от RAPD своими характеристиками [34]. Так, RAPD менее специфична и хуже воспроизводится: любая мутация в комплементарном праймеру участке матрицы приводит к тому, что короткий праймер не гибридизуется с ним, и соответствующей полосы в геле не будет. Удлинение праймеров в rep-PCR до 20–22 н. сильно повышает воспроизводимость результатов.
Асимметричная ПЦР
Асимметричную реакцию (asymmetric PCR) проводят при желании получить амплифицированную копию участка только одной из цепей ДНК — например, для последующей гибридизации. В таком случае в реакционной смеси концентрация одного праймера должна быть намного выше, чем другого, и тогда на выходе будут превалировать фрагменты нужной цепи.
Метилспецифичная ПЦР
Геномная ДНК живых организмов, как правило, метилирована: после синтеза ДНК к небольшому проценту цитозинов и аденинов фермент ДНК-метилтрансфераза присоединяет метильную группу. Цели метилирования разнообразны: от регуляции экспрессии отдельных генов до регуляции целых процессов, таких как старение или канцерогенез.
Это свойство геномной ДНК эксплуатирует метилспецифичная ПЦР (methylation-specific PCR). Такой вариант ПЦР применяют, чтобы понять, метилирован ли определенный участок ДНК по цитозину.
Перед постановкой реакции ДНК-матрицу обрабатывают бисульфитом. Он преобразует неметилированные цитозины в урацилы, которые распознаются праймерами и полимеразой как тимины, а метилированные цитозины не трогает. Затем проводят две реакции с разными праймерами: в одну пробирку вносят праймеры, специфичные к последовательности с цитозинами, а в другую — к последовательности с урацилами. Если амплификация прошла в первой пробирке, значит ДНК на этом участке метилирована, если во второй — не метилирована.
ПЦР со вложенной парой праймеров
Она же — вложенная или гнездовая ПЦР (nested PCR). Полезна для уменьшения вероятности амплификации неспецифических фрагментов. Если, например, какие-то из праймеров «сядут» на незапланированные участки, после электрофореза в геле можно получить несколько полос — целевого фрагмента и побочных. Чтобы повысить специфичность реакции, используют два набора праймеров: первый — для амплификации более длинного фрагмента, второй — для амплификации внутреннего участка этого фрагмента (рис. 17). Несколько раундов ПЦР проводят с первым набором, а затем добавляют второй. Чтобы избежать продолжения амплификации с первыми праймерами, оба набора разрабатывают для отжига при разных температурах [24].
Рисунок 17. Схема вложенной ПЦР.
Инвертированная ПЦР
Этот вариант используют, когда известна последовательность (сиквенс) какого-то участка ДНК, но нужно амплифицировать вовсе не его, а то неизвестное, что его окружает. Например, необходимо узнать, в какое место генома встроился вирус с известным сиквенсом. Тогда-то и приходит на помощь инвертированная ПЦР (inverse PCR), которая состоит из нескольких этапов (рис. 18):
Рисунок 18. Схема инвертированной ПЦР.
ПЦР с перекрывающимися праймерами
Чаще всего для соединения двух фрагментов двухцепочечной ДНК используют метод рестрикции/лигирования, когда края этих фрагментов разрезают одинаковыми эндонуклеазами с образованием «липких» концов, а потом соединяют их с помощью лигазы. Однако с этой целью можно применять и метод ПЦР.
ПЦР с перекрывающимися праймерами, или продлением перекрывания (overlap extension PCR), выполняется в несколько этапов (рис. 19):
Этот же вариант ПЦР, но с небольшими модификациями, используют и для внесения мутаций, например, если из длинного фрагмента ДНК надо удалить какой-то участок.
Рисунок 19. Схема ПЦР с перекрывающимися праймерами.
Сборочная ПЦР
Этот вариант похож на предыдущий. Его используют для сборки синтетических молекул ДНК из отдельных фрагментов, например, чтобы получить синтетические гены или даже целые геномы.
В сборочной ПЦР (assembly PCR) используют одноцепочечные олигонуклеотиды длиной до 50 н., одна часть которых предназначена для образования одной цепи ДНК, а другая — для образования другой (рис. 20). Важно, чтобы эти олигонуклеотиды частично перекрывались концами (примерно на 20 нуклеотидов) с «соседями» на будущей противоположной цепи, поскольку они сами будут работать и праймерами, и матрицей. Во время первых 30 циклов ПЦР концы олигонуклеотидов удлиняются по матрице фрагментов противоположной цепи. К концу процесса каждый олигонуклеотид удлинится настолько, что превратится в отдельную цепочку будущей синтетической ДНК. Тогда в реакцию добавляют пару праймеров, комплементарных концам этой ДНК, и проводят дополнительные 23 цикла, получая на выходе множество копий синтетической ДНК.
Рисунок 20. Схема сборочной ПЦР.
Рисунок 21. Схема твердофазной ПЦР.
Твердофазная ПЦР
Ее применяют, например, для получения ДНК-микрочипов или при секвенировании на платформе Illumina. К твердой поверхности 5ˊ-концами пришивают праймеры, добавляют реакционную смесь и проводят твердофазную ПЦР (solid phase PCR, рис. 21). В первом цикле удлиняется некоторое количество праймеров, затем проводят промывку, чтобы удалить свободно плавающие в растворе ДНК-матрицы, добавляют новый раствор (но уже без матриц) и продолжают ПЦР. Одноцепочечные ДНК, торчащие над поверхностью, на этапе отжига изгибаются и гибридизуются с какими-то из соседних праймеров, становясь матрицами для удлинения этих праймеров. На этапе денатурации обе цепи расходятся, но всё равно остаются прикрепленными к поверхности, так как представляют собой продолжения праймеров [35].
In situ ПЦР
Это реакция, которую проводят непосредственно в клетках или тканях, например, для изучения внутриклеточного развития вирусов. Сначала клетки или ткань фиксируют на предметном стекле и обрабатывают протеазой, чтобы расщепить белки и освободить ДНК (или РНК, если собираются проводить ОТ-ПЦР). Затем прямо на стекло добавляют смесь для ПЦР и ставят препарат в амплификатор. Выявляют получившиеся фрагменты либо ДНК-гибридизацией, либо иммунологическими методами.
Капельная цифровая ПЦР
Цифровая ПЦР (digital PCR) — более точный и воспроизводимый метод количественного определения ДНК, чем ПЦР в реальном времени. Стандартная ПЦР проходит во всём объеме образца, а при цифровой пробу делят на большое количество маленьких субъединиц (компартментов) и проводят ПЦР в каждой из них отдельно. Методы разделения на компартменты в различных технологиях цифровой ПЦР отличаются друг от друга (используют масляную эмульсию, капилляры и т.д.), а реакцию проводят в планшетах с микролунками. Результаты визуализируют чаще всего с помощью системы TaqMan, но иногда применяют и интеркалирующие агенты, например, зеленую флуоресцирующую краску EvaGreen.
Метод цПЦР разработали австралийцы Алек Морли и Памела Сайкс в 1992 году, когда исследовали больных лейкемией [36]. В последующие годы разные исследовательские группы разрабатывали свои варианты, в том числе и варианты компартментализации. К сожалению, все они имели существенный недостаток — высокую трудоемкость: пробу надо было разделять на сотни (а то и тысячи) реакций объемом по нескольку микролитров каждая или проводить дополнительные реакции (например, иммобилизацию праймеров на магнитных шариках и гибридизацию продуктов ПЦР с флуоресцентными пробами, как в технологии BEAMing), а затем отдельно анализировать результаты.
От этих проблем экспериментаторов избавила капельная цифровая ПЦР (кцПЦР), или по-английски droplet digital PCR (ddPCR). Общепризнанным лидером в этой области является система цифровой капельной ПЦР — QX200 производства компании Bio-Rad. Эту методику разработала компания QuantaLife, а в 2011 году Bio-Rad приобрела права на технологию [37]. На рынке существует еще несколько систем капельной цифровой ПЦР: QuantStudio 3D и QuantStudio 12K Flex (обе производства Thermo Fisher Scientific), Biomark HD (от Fluidigm), а также RainDrop Plus (от RainDance Technologies), недавно купленный компанией Bio-Rad, но QX200 явно доминирует — за последние несколько лет систему упоминали в более чем 600 публикациях.
В ddPCR из 20 мкл образца, в котором требуется определить количество исследуемой ДНК, создают водно-маслянную эмульсию. Реакционную смесь разделяют на приблизительно 20 000 капель-реакций объемом около 1 нл каждая с помощью автоматического генератора капель (рис. 22). При этом генетический материал распределяется по каплям случайным образом: в них попадают как ДНК-мишени, так и фоновая ДНК. Процесс распределения целевой ДНК по каплям чисто случайный и подчиняется закону распределения малых чисел Пуассона. Перед разделением образца на капли не обязательно разводить его до концентрации, чтобы в каждой капле было либо 0, либо 1 копия ДНК-мишени: при анализе результатов учитываются ситуации, когда в одной капле находится более одной копии мишени.
Рисунок 22. Схема цифровой ПЦР с использованием системы QX200™ от Bio-Rad.
Капли вносят в 96-луночный планшет для ПЦР и помещают в циклер. Реакция проходит независимо в каждой капле (подробное руководство по капельной цифровой ПЦР на английском языке доступно на сайте Bio-Rad: Droplet Digital TM PCR Applications Guide). В тех каплях, куда попала ДНК-мишень, образуется ПЦР-продукт, что приводит к увеличению уровня флуоресцентного сигнала от флуоресцентной метки: либо TaqMan-зондов, либо интеркалирующего красителя. После ПЦР в специальном устройстве (ридере) капли независимо друг от друга проверяют на наличие или отсутствие в них флуоресцентного сигнала (рис. 23). Количество капель с положительным и отрицательным сигналами подсчитывают для каждого образца, а программное обеспечение выдает концентрацию ДНК-мишени в виде числа копий в микролитре. Анализ продукта проходит в конечной точке после проведения ПЦР [38].
Рисунок 23. Автоматическая шприц-пипетка ридера капель извлекает капли из каждой лунки планшета для ПЦР.
В кцПЦР определение количества ДНК-мишени проводят не относительно, используя калибровочную кривую, как в случае с ПЦР в реальном времени, а прямым подсчетом капель с наличием или отсутствием в них ДНК-мишени. Это существенно увеличивает стабильность системы и ее устойчивость к ингибиторам ПЦР.
При наличии только двух флуоресцентных каналов (FAM и HEX/VIC) система позволяет запускать 4—5-плексные реакции за счет использования смеси зондов с одной нуклеотидной последовательностью, но меченных красителями FAM и HEX/VIC в различных пропорциях. Возможно также проводить 2—3-плексные реакции с интеркалирующим красителем EvaGreen, используя различную «емкость» разноразмерных ПЦР-продуктов для интеркалятора, что позволяет независимо подсчитать количество этих продуктов по разнице уровня их флуоресценции.
С помощью капельной цифровой ПЦР можно определять:
Метод активно используют в различных областях, но наиболее часто при:
Несмотря на сходство применения цифровой ПЦР и ПЦР в реальном времени, скорее всего, в будущем ddPCR будет постепенно вытеснять real-time PCR как основной ПЦР-метод количественного определения ДНК.
Альтернативы ПЦР
В этой главе опишем наиболее интересные и перспективные методы изотермической амплификации, которые могут составить конкуренцию стандартной ПЦР, если нужно узнать, есть ли в пробе та или иная последовательность. Эти методы особенно полезны для медицины и сельского хозяйства в полевых условиях, когда нужно обнаружить патогены в образцах растительного или животного происхождения. Если же перед экспериментатором стоят генно-инженерные цели, например, клонирование генов, то здесь, конечно, ПЦР вне конкуренции.
Опосредованная образованием петель изотермическая амплификация
Метод описали японские ученые в 2000 году [39]. LAMP (loop-mediated isothermal amplification) использует Bst-полимеразу из Geobacillus stearothermophilus, совмещающую полимеразную и хеликазную активности, что дает возможность исключить фазу денатурации и проводить реакцию при 60–65 °С. Подробно о методе написано в статье «Поиск иголки в стоге сена за 10 минут — подсвети себе LAMPой» [40].
LAMP, в отличие от обычной ПЦР, использует не два, а четыре или шесть праймеров, что увеличивает специфичность реакции, но в то же время повышает вероятность артефактов и эффекта множественности полос в электрофорезном геле. Однако это, по сути, не недостаток, так как метод рассчитан на детектирование результата невооруженным глазом («позитив»/«негатив») без электрофореза.
Хеликазозависимая амплификация
В 2004 году сотрудники компании New England Biolabs (NEB) предложили свою альтернативу полимеразной цепной реакции — хеликазозависимую амплификацию (helicase-dependent amplification, HDA). В реакции авторы предложили использовать хеликазу UvrD Escherichia coli, SSB-белки gp32 фага Т4 и фрагмент Клёнова exo− (рис. 24). Хеликаза раскручивает ДНК, SSB-белки стабилизируют цепи в разделенном состоянии, а фрагмент Клёнова синтезирует новую ДНК от 3ˊ-конца праймеров. Реакция проходит при 37 °С. Однако если перед ее постановкой провести денатурацию ДНК при 95 °С, эффективность повышается в 1,5–2 раза [41], [42]. Коммерческие наборы, выпускаемые сейчас NEB, вместо фрагмента Клёнова содержат Bst-полимеразу, а вместо UvrD E. coli — термостабильную хеликазу UvrD Thermoanaerobacter tengcongensis (Tte-UvrD), что позволяет проводить реакцию при 65 °С [43].
Рисунок 24. Схема хеликазозависимой амплификации.
К сожалению, у этого метода есть и недостатки. Для получения результатов, сравнимых с результатами стандартной ПЦР, всё-таки необходимо провести предварительную денатурацию образца. К тому же максимальный размер амплифицируемого фрагмента не превышает 120 п.н. Однако по некоторым данным, HDA улавливает в пробе меньшую концентрацию целевой ДНК, чем LAMP [44]. А если использовать хелимеразу (особым образом сшитые Tte-UvrD и Bst-полимеразу), созданную компанией BioHelix, то размер амплифицируемого фрагмента увеличивается до 1,5 т.п.н. [45].
Рекомбиназная полимеразная амплификация
В 2006 году британские ученые из биотехнологической компании TwistDX LTD разработали метод изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации (РПА), который может составить сильную конкуренцию как обычной ПЦР, так и ПЦР в реальном времени [46].
Главное отличие РПА от обычной ПЦР в том, что реакция может проходить при комнатной температуре (25 °С), а оптимально — при 37–40 °С. В РПА используют большой фрагмент Bsu-полимеразы, SSB-белки gp32 фага Т4 и его же рекомбиназу uvsX. Часть молекул рекомбиназы связывают с одним праймером, часть — с другим. После внесения в реакционную смесь такие молекулы сканируют ДНК в поисках комплементарных праймеру участков и, найдя их, инициируют процесс расплетения двухцепочечной молекулы и присоединения праймера (рис. 25). Расплетенную ДНК стабилизируют SSB-белки, а полимераза начинает синтез. Процесс АТФ-зависимый, поскольку энергия нужна для освобождения 3ˊ-конца праймера от молекул рекомбиназы. Размер амплифицируемого фрагмента ограничивается тысячей пар нуклеотидов, а минимальная длина праймера должна быть 30 н. для повышения его специфичности [46].
Рисунок 25. Схема рекомбиназной полимеразной амплификации.
Процесс может длиться 15–30 минут, включая экстракцию образцов, что намного быстрее стандартной ПЦР [47]. Этот метод амплификации лишен значительных недостатков (кроме требования строгого соблюдения условий реакции) и может легко модифицироваться в РПА с обратной транскрипцией и РПА в реальном времени — как с интеркалирующими агентами, так и с флуоресцентными зондами.
Весной 2017 года американские ученые предложили на основе рекомбиназной полимеразной амплификации в сочетании с технологией CRISPR-Cas новый метод диагностики — SHERLOCK. О нем «Биомолекула» уже рассказывала в статье «SHERLOCK — молекулярный сыщик спешит на помощь!» [48].
Компания Bio-Rad — партнер этой публикации
Компания Bio-Rad Laboratories, Inc USA («Био-Рад», США) является одним из мировых лидеров производства оборудования и реагентов для научных исследований. В рамках взаимодействия с научными, медицинскими, биотехнологическими и образовательными организациями «Био-Рад» предлагает современные технологии, оборудование и реагенты.
Система для капельной цифровой ПЦР
Высокопроизводительные ПЦР-системы Bio-Rad — это новейшие технологические достижения, обеспечивающие непревзойденную точность и воспроизводимость геномных экспериментов. Линейка продуктов включает в себя термоциклеры, системы для ПЦР в реальном времени, реагенты для ПЦР и пластик, а также новую систему капельной цифровой ПЦР QX200 Droplet Digital PCR System для абсолютной количественной оценки ДНК-мишени в образце.
Геномные технологии (генная экспрессия и генная модуляция)
Протеомные технологии (структурная и функциональная протеомика)
Клеточные технологии
Материал предоставлен партнёром — компанией «Био-Рад»
Применение ПЦР
1. Клиническая медицина
2. Криминалистика и судебная медицина
3. Генная инженерия
4. Антропология, палеонтология
5. Сельское хозяйство
Полимеразная цепная реакция — один из самых мощных и дешевых лабораторных методов. Его появление привело к воистину революционным изменениям в науке и медицине. И если сейчас для генетических экспресс-анализов появляются альтернативные техники, не требующие сложной аппаратуры, то в генетической инженерии ПЦР по-прежнему просто незаменима. Пожалуй, самые ценные свойства этого метода — совместимость с другими техниками и невероятная пластичность: они позволяют биологам и врачам с минимальными усилиями решать совершенно разные задачи. А главное, метод пока не исчерпал свой потенциал: до сих пор появляются всё новые его варианты, и, возможно, нас еще не раз удивят остроумные и неожиданные протоколы экспериментов, основанных на ПЦР.
Календарь
На основе статей спецпроекта мы решили сделать календарь «12 методов биологии» на 2019 год. Эта статья представляет февраль.