для выделения гемокультуры используется какая среда
Система для выделения гемокультур HiSafe
HiSafe Blood Culturing System
Одним из важнейших материалов, поступающих для исследования в микробиологическую лабораторию, является кровь. Известно, что в норме кровь стерильна, поэтому выделение гемокультуры имеет принципиальное значение для диагностики, в частности, таких состояний, как эндокардит, тифо-паратифозные заболевания и сальмонеллезы, пневмония, осложненный нагноением тромбофлебит, инфекции, связанные с пластикой сосудов и др. (1). Ввиду того, что концентрации микроорганизмов в крови при бактериемиях, как правило, невысоки, для посева необходимо брать достаточно большое количество крови. Естественная бактерицидная/бактериостатическая активность крови, наряду с предшествующей антибиотикотерапией, могут быть причиной отрицательного или несвоевременно полученного положительного результата исследования на гемокультуру (2). Соответственно, для инактивации бактерицидных свойств крови и обеспечения роста бактерий в качестве нетоксичного антикоагулянта можно применять такое вещество, как SPS (натрия полианетолсульфонат) (3, 4, 5). SPS подавляет активность стрептомицина (6), полимиксина В, канамицина и гентамицина. Полезность SPS для выделения гемокультур первыми показали Van Haebler и Miles.
Система для выделения гемокультур HiSafe предназначена для быстрого, эффективного и простого выделения гемокультур и их предварительной идентификации. Все питательные среды, входящие в систему ХайСейф (смотри ниже), специально разрабатывались для выращивания разнообразных клинически значимых микроорганизмов, как неприхотливых, так и прихотливых видов.
 |
Методика
Кровь у больного берут (предпочтительно до назначения антимикробной терапии) стерильным инструментом и асептично переносят во флакон системы HiSafe, содержащий соответствующую питательную среду (выбор среды зависит от свойств предполагаемого возбудителя). Засеянные флаконы инкубируют в термостате и отмечают появление мутности, изменение цвета среды, гемолиза и/или газообразования.
Взятие материала
Ход исследования
Учет результатов
Признаки роста появляются обычно через 48 ч. Для подтверждения отрицательного результата флаконы продолжают инкубировать в течение 7 дней. Для идентификации выделенных гемокультур требуется посев на соответствующие дифференциальные среды.
Примечание: схемы идентификации выделенных гемокультур можно найти в соответствующих Руководствах (7 и др.).
Возможные причины ложного результата
На выделение гемокультуры оказывают влияние разные факторы:
Важные указания: используют только для диагностики in vitro.
Не использовать флаконы с трещинами или другими дефектами, а также с признаками контаминации питательной среды. Перед выбрасыванием все флаконы необходимо обеззараживать автоклавированием при 1 атм (121° С) в течение 15 мин. Перед автоклавированием отвинчивают крышку флакона и приоткрывают его резиновую пробку.
Двойная среда HiCombi LQ033 (предназначена для детских анализов) и LQ012 (предназначена для взрослых анализов) :
Представляет собой флакон (стеклянный или поликарбонатный) с комбинацией 7мл агара, омываемого 20 мл бульона (LQ033) 20 мл агара, омываемого 40 мл бульона (LQ012). Бульонные среды богаты факторами роста, что позволяет выращивать как факультативные, так и облигатные анаэробы, вызывающие бактериемию. Специальный пептон является источником различных аминокислот, дрожжевой экстракт – витаминов, а гемин и НАД являются факторами роста таких прихотливых микроорганизмов, как Haemophilus spp. Комбинированная среда рекомендуется для получения быстрого роста энтеробактерий, псевдомонад, стафилококков, стрептококков и грибов Candida.
Состав сред **
Ход исследования (рекомендуется для всех двухфазных сред HiCombi)
1. Засеять среду, как описано для системы HiSafe.
2. Инкубировать при 35± 2° С в течение 4-6 ч. Наклонить систему так, чтобы поверхность агара была смочена бульоном.
НЕ ВСТРЯХИВАТЬ СИСТЕМУ И НЕ ДЕРЖАТЬ В НАКЛОННОМ ПОЛОЖЕНИИ БОЛЕЕ 15 СЕКУНД.
3. Придать системе вертикальное положение и инкубировать при 35± 2° С в течение 18-24 ч или дольше (при необходимости).
4. Для выделения культур аэробов можно применять аэраторы, как это описано для системы HiSafe.
Питательная среда для выделения гемокультуры при диагностике брюшного тифа и паратифов
Изобретение относится к медицине, может быть использовано при бактериологическом исследовании крови на гемокультуру сальмонелл. Среда содержит агар и натрий углекислый, желчь бычью, питательный бульон из рыбы, маннит, феноловый красный. Среда обладает высоким накопительным эффектом и обеспечивает четкую дифференциацию паратифозных бактерий от тифозных по признаку газообразования. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано при бактериологическом исследовании крови на гемокультуру.
Метод получения гемокультуры является наиболее ранним и надежным методом бактериологической диагностики сальмонелл брюшного тифа и паратифов.
Известны среды для выделения гемокультуры сальмонелл: желчный бульон, бульон с 1% глюкозой, стерильная дистиллированная вода (1). Недостатком желчного бульона является то, что он не позволяет дифференцировать сальмонеллы по признаку газо- и кислотообразования, так как в его составе отсутствует индикатор и углевод. Глюкозный бульон обладает низким накопительным эффектом, так как не подавляет бактерицидные свойства крови. Дистиллированная вода не обладает накопительным эффектом ввиду отсутствия питательных веществ, ей присущи также и все другие указанные выше недостатки.
К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной среды, принятой за прототип, являются слабые накопительные и дифференцирующие свойства среды, что вызывает необходимость инкубации посевов в течение 6-10 суток (2, 3). По этой причине удлиняются сроки постановки диагноза.
Введение в предлагаемую среду маннита вместо глюкозы и дополнительно натрия углекислого обеспечивает более интенсивное образование бактериями газа, а агар способствует удерживанию пузырьков газа на поверхности и в толще среды, что позволяет провести четкую дифференциацию паратифозных бактерий, продуцирующих газ, от тифозных, не обладающих этим признаком.
Использование в среде индикатора фенолового красного, обладающего высокой чувствительностью к изменению pH среды, происходящего в результате сбраживания маннита сальмонеллами, позволяет провести визуальную оценку изменения цветной реакции среды.
Среду получают следующим образом.
Качество среды оценивают также визуально по наличию газа и по изменению цвета среды.
Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в 0,5 л дистиллированной воды последовательно растворяют 15 г питательного бульона из рыбы, 15 г сухой желчи, 15 г маннита, 1,5 г агара, 0,3 г натрия углекислого, 0,04 г индикатора фенолового красного, объем смеси доводят дистиллированной водой до 1 л. Далее согласно примеру 1.
Пример 3. Отличается от примера 1,2 тем, что в 0,5 л дистиллированной воды последовательно растворяют 20 г питательного бульона из рыбы, 20 г сухой желчи, 20 г маннита, 2,0 г агара, 0,4 г натрия углекислого, 0,05 г индикатора фенолового красного, объем смеси доводят дистиллированной водой до 1 л. Далее согласно примеру 1.
Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной сред представлены в таблице.
Данные таблицы свидетельствуют о заметном превосходстве предлагаемой среды перед известной. Так, накопительный эффект предлагаемой среды более чем 100 раз превосходит известную среду, что делает возможным выявление сальмонелл при меньшем их исходном количестве в исследованном материале (крови).
Дифференцирующие свойства по признаку газообразования более выражены на предлагаемой среде.
Указанные преимущества предлагаемой среды повышают эффективность диагностики тифо-паратифозной инфекции при исследовании крови на гемокультуру.
Источники информации 1. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982, стр. 5.
2. Ф. К. Черкес, Л.Б. Богоявленская, Н.А. Бельская. Микробиология. М.: Медицина, 1986, стр. 286.
3. Энтеробактерии. Руководство. Под ред. В.И. Покровского. М.: Медицина, 1985, стр. 31.
4. Там же, стр. 262 (прототип).
Напечатано: Адрес для переписки: 367025, г. Махачкала, ул. Леваневского, 24, НПО “Питательные среды”
Следует читать: Адрес для переписки: 119021, Москва, Зубовский б-р, 4, ФГУП “НПО “Микроген”, патентно-лицензионный отдел
Номер и год публикации бюллетеня: 31-2001
Готовые питательные среды во флаконах для выделения гемокультур
Спектр продукции ХайСейф и ХайКомби
Два шага в одной процедуре, включающей инокуляцию материала и одновременное выделение изолированных колоний на поверхности плотной фазы.
HiSafe Blood Culturing System & HiCombi Dual Performance Medium
Система для выделения гемокультур HiSafe и HiCombi
Одним из важнейших материалов, поступающих для исследования в микробиологическую лабораторию, является кровь. Известно, что в норме кровь стерильна, поэтому выделение гемокультуры имеет принципиальное значение для диагностики, в частности, таких состояний, как эндокардит, тифо-паратифозные заболевания и сальмонеллезы, пневмония, осложненный нагноением тромбофлебит, инфекции, связанные с пластикой сосудов и др. (1). Ввиду того, что концентрации микроорганизмов в крови при бактериемиях, как правило, невысоки, для посева необходимо брать достаточно большое количество крови. Естественная бактерицидная/бактериостатическая активность крови, наряду с предшествующей антибиотикотерапией, могут быть причиной отрицательного или несвоевременно полученного положительного результата исследования на гемокультуру (2). Соответственно, для инактивации бактерицидных свойств крови и обеспечения роста бактерий в качестве нетоксичного антикоагулянта можно применять такое вещество, как SPS (натрия полианетолсульфонат) (3, 4, 5). SPS подавляет активность стрептомицина (6), полимиксина В, канамицина и гентамицина. Полезность SPS для выделения гемокультур первыми показали Van Haebler и Miles.
Система для выделения гемокультур HiSafe предназначена для быстрого, эффективного и простого выделения гемокультур и их предварительной идентификации. Все питательные среды, входящие в систему ХайСейф (смотри ниже), специально разрабатывались для выращивания разнообразных клинически значимых микроорганизмов, как неприхотливых, так и прихотливых видов.
Методика
Кровь у больного берут (предпочтительно до назначения антимикробной терапии) стерильным инструментом и асептично переносят во флакон системы HiSafe, содержащий соответствующую питательную среду (выбор среды зависит от свойств предполагаемого возбудителя). Засеянные флаконы инкубируют в термостате и отмечают появление мутности, изменение цвета среды, гемолиза и/или газообразования.
Взятие материала
Для выделения гемокультуры используется какая среда
а) Двухфазная среда для гемокультур (для неприхотливых бактерий). Твердая фаза представляет собой стерильный питательный агар, около 30,0 мл (МПА, сахарный МПА), скошенный во флаконе емкостью 100 мл. Жидкая фаза — стерильный бульон (МПБ, сахарный МПБ и др.), асептически добавленный во флакон с застывшим скошенным агаром.
Количество бульона должно быть таковым, чтобы его уровень доходил до 1/2 высоты скошенной поверхности (около 30-40 мл). После внесения образца крови смесь бульона и крови тщательно перемешивают и осторожно (чтобы не смочить пробку) смачивают ею скошенную поверхность агара. Выросшая гемокультура развивается не только в бульоне, но и на агаре, что позволяет визуально установить ее чистоту, а также облегчает и ускоряет дальнейшую идентификацию по основным биологическим признакам, в том числе определение чувствительности.
б) Бульон БК HiMedia, ВС Broth. Бульон БК используют как многоцелевую среду для культивирования широкого спектра микроорганизмов и выделения гемокультур.
Бульон стимулирует обильный рост аэробных, анаэробных и микроаэрофиль-ных микроорганизмов. Может быть использован для определения стерильности растворов и биологических продуктов.
Состав, г/л:
Пептон протеозный — 20,0
Экстракт говяжий — 3,0
Экстракт дрожжевой — 3,0
Экстракт солодовый — 3,0
Декстроза — 5,0
Аскорбиновая кислота — 0,2
pH 7,2±0,2
Суспендируют 35,2г сухой смеси в 1000,0 мл холодной дистиллированной воды. Нагревают до кипения, затем продолжают нагрев до полного растворения. Разливают в пробирки и флаконы. Стерилизуют автоклавированием 15 мин при 121°С.
Если среду не используют в день приготовления, рекомендуется удалить растворенный газ путем кипячения или текучим паром в автоклаве. Охлаждают, избегая взбалтывания.
в) Сердечно-мозговой бульон HiMedia, Brain Heart Infusion Broth. Бульон с сердечно-мозговой вытяжкой для выделения гемокультур стрептококков, пневмококков, менингококков и других прихотливых микроорганизмов.
Состав:
Вытяжка телячьего мозга — 200,0
Вытяжка коровьего серди, — 250,0
Пептон протеозный — 10,0
Декстроза (глюкоза) — 2,0
Натрия хлорид — 5,0
Динатрий фосфат — 2,5
pH 7,4±0,2
Суспендируют 37,0 г сухой смеси в 1000,0 мл дистиллированной воды. Разливают в пробирки или флаконы. Стерилизуют автоклавированием 15 мин при 121°С. Добавление 1,0 г агара на 1000,0 мл среды стимулирует рост микроаэрофилов и анаэробов. Для достижения лучших результатов среду следует использовать в день приготовления.
г) Основа колумбийского бульона (среда для гемокультур) HiMedia, Columbia Broth Base. Среду используют для культивирования прихотливых микроорганизмов, таких как N. meningitidis, S. pyogenes, S. mitis, C. perfringens.
Состав, г/л:
Пептон (специальный) — 10,0
Биопептон — 10,0
Настой сердца (сухой) — 3,0
L-цистинагидрохлорид — 0,1
Глюкоза — 2,5
Натрия хлорид — 5,0
Магния сульфат — 0,1
Железа сульфат — 0,02
Натрия карбонат — 0,6
Трис (гидроксиметиламинометан) — 0,83
Трис (гидроксиметиламинометана гидрохлорид) — 2,86
pH 7,5±0,2
Суспендируют 35,0 г порошка в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения. При необходимости добавляют SPS (полианетол-сульфат натрия) до конечной концентрации 0,01. Разливают в пробирки, флаконы, стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при 121°С. Готовая среда имеет янтарный цвет.
Для лучшего выделения аэробных и анаэробных микроорганизмов можно повысить содержание цистина.
Для выделения N. meningitidis полианетол-сульфат натрия не применяют, так как он задерживает рост этого микроорганизма.
д) Тиогликолевая среда. Используется для определения стерильности материалов, фармакологических препаратов и объектов внешней среды, а также для гемокультур и культивирования факультативных и облигатных анаэробных микроорганизмов, обогащения исследуемого материала.
Состав, г/л:
Пептон — 20,0
Глюкоза — 6,0
Натрия хлорид (NaCl) — 2,5
Тиогликолят натрия — 0,5
Сульфит натрия (Na2SO3 * 7H2O) — 0,1
Бикарбонат натрия (NaHCO3) — 1,0
Агар — 0,7
pH 7,2±0,2
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.2.2020
Способ выделения гемокультуры
Использование: микробиология. Сущность изобретения: проводят фильтрацию крови, концентрирование микроорганизмов на твердых сорбентах, обработку сорбентов жидкой питательной средой, обеспечивающих десорбцию микроорганизмов и инактивацию антибиотиков, с последующей инкубацией и исследованием. Причем фильтрацию крови и концентрирование микроорганизмов ведут во время сеанса гемадсорбции, а питательная среда содержит препарат «Гемодез», к которому добавлены равные количества 2%-ного раствора глюкозы на 0,9%-ном водном растворе хлористого натрия. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии и может быть использовано как способ выделения микроорганизмов в диагностических целях, например, при диагностике сепсиса.
Известен способ выделения гемокультуры при подозрении на сепсис, для чего стерильно взятую кровь в объеме 4-10 мл засевают в колбу с 50-100 мл сахарного бульона, содержащего 2% глюкозы. Посевы помещают в термостат и культивируют в оптимальных температурных условиях. Наличие бактерий выявляют микроскопией и бактериологическим исследованием [1] Недостатком известного способа является его низкая диагностическая чувствительность, обусловленная малым объемом используемой крови. Даже при наличии сепсиса, особенно вялотекущего, в 10 мл крови микробов может не оказаться.
Известен способ выделения и концентрации микроорганизмов из воды, включающий пропускание ее через сорбционные колонки с ионообменными смолами, десорбцию микроорганизмов растворами солей определенной концентрации и индикацию микроорганизмов в концентрате [2] Данный способ не обеспечивает роста микроорганизмов в концентрате из-за высокого содержания в нем десорбирующих солей. Для выделения микробов из крови этот способ не применялся.
Известна питательная среда с гемолизированной кровью для выделения гемокультуры полужидкий агар Хоттингера с предварительным гемолизом крови, содержащий 0,15% агара, 2% глюкозы, хлористого натрия и воду [3] Для выделения гемокультуры на этой среде используют 5 мл крови больного. Среда считается одной из лучших для выделения гемокультуры и наиболее близка к предлагаемой среде. Недостатком данной среды является отсутствие в ее составе веществ, способных нейтрализовать антибиотики, которые используются при лечении сепсиса и попадают вместе с кровью в питательную среду, подавляя рост микробов.
Известен способ выделения гемокультуры путем удаления микробных клеток из крови, фильтрации плазмы и концентрирования микробов на фильтре с последующей инкубацией фильтра на поверхности плотной питательной среды [4] Чувствительность этого способа повышается пропорционально увеличению объема используемой крови. Этот способ является наиболее близким техническим решением к предлагаемому. Недостатком известного способа является то, что применяемые для достижения высокой чувствительности большие объемы крови необратимо теряются для больного. Кроме того, извлечение клеток крови перед фильтрацией ведет к потере микробов, так как часть их адсорбируется на мембранах эритроцитов.
Целью предлагаемого изобретения является повышение чувствительного способа выделения гемокультуры и усовершенствование питательной среды для обеспечения десорбции микробов и нейтрализации содержащихся в крови антибиотиков.
Поставленная цель достигается тем, что фильтрацию крови и концентрирование микробов ведут в процессе экстракорпоральной гемоперфузии на твердых сорбентах; затем отработанную колонку с сорбентом заполняют жидкой питательной средой, которая обеспечивает десорбцию микробов и инактивирование антибиотиков и состоит из стандартного лечебного препарата «Гемодез» и равного количества стерильного 2% раствора глюкозы на 0,9 водном растворе хлористого натрия; заполненную питательной средой колонку с сорбентом инкубируют в оптимальных условиях роста микробов, после чего подвергают культуру бактериоскопическому и бактериологическому исследованию.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Больному производят экстракорпоральную гемоперфузию /гемосорбцию/ на твердых сорбентах, напрмиер, на угле СКТ-6. После сеанса гемосорбции колонку отключают от сосудистой системы человека, например, венозной, и отработанную колонку 3 с сорбентом, пропитанным кровью, заполняют жидкой питательной средой указанного состава. После этого колонку встряхивают в течение 15-20 мин и инкубируют при оптимальной температуре до помутнения среды, а затем исследуют содержимое посева. Для приготовления питательной среды смешивают равные объемы лечебного препарата «Гемодез» и стерильного 2% раствора глюкозы на 0,9% водном растворе хлористого натрия. Лечебный препарат «Гемодез» представляет собой водно-солевой раствор, содержащий 6% низкомолекулярного поливинилпирролидона с молекулярной массой 12600
2 700 и ионы натрия, калия, кальция, магния и хлора, и применяется для дезинтоксикации организма [5] Эффективность способа проверена в ряде опытов. Результаты хорошо воспроизводимы. Рост микробов не предлагаемой среде отмечается, как правило, через 24-48 ч, тогда как при использовании известных питательных сред /сахарный бульон/ рост микробов в колонке наблюдается на 7-е сутки. Сравнительные с аналогом результаты представлены в таблице.
Из приведенных 15 случаев до гемосорбции положительный результат при использовании стандартного метода / аналога/ получен в 2 случаях, тогда как применение предложенного способа дало положительные результаты в 14 случаях. Из 8 случаев параллельного использования при гемосорбции прототипа питательной среды положительный результат отмечен лишь в 1 случае.
Преимуществом предлагаемого способа является то, что фильтрации во время сеанса гемосорбции подвергается значительный объем крови /около 5-10 л/, что создает реальные условия для выделения предельно малого количества микробов из крови. Адсорбции микробов на мембранах эритроцитов не происходит, так как адсорбционная способность у угля значительно выше, чем у эритроцитов. Микробы можно выделять из лимфы, спинномозговой жидкости, асцита и плазмы.
Способ выделения гемокультуры, включающий фильтрацию крови с последующим концентрированием бактерий и инкубацией их на сорбенте в питательной среде, отличающийся тем, что фильтрацию крови и концентрирование бактерий проводят при экстракорпоральной гемоперфузии, а инкубацию осуществляют в питательной среде, содержащей равные объемы препарата «Гемодез» и 2%-ного раствора глюкозы на 0,9%-ном водном растворе хлористого натрия.